ࡱ> [rbjbj?ΐΐj4( ( vvvvv89"HJJJJJJ$)˳nv|||nvv888|4 vvH8|H88D@H f 4 094(DDdv $QB08\uqnnz9||||(  <: Szczepionka przeciw boreliozie, konstrukt genetyczny, rekombinowane biaBko, sposb otrzymywania konstruktu genetycznego, sposb otrzymywania szczepionki, sposb otrzymywania rekombinowanych biaBek, zastosowanie rekombinowanych biaBek do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie Przedmiotem wynalazku jest szczepionka przeciw boreliozie, konstrukt genetyczny, rekombinowane biaBko, sposb otrzymywania konstruktu genetycznego, sposb otrzymywania szczepionki, sposb otrzymywania rekombinowanych biaBek, zastosowanie rekombinowanych biaBek do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie. Bardziej szczegBowo rozwizanie dotyczy zastosowania rekombinowanych biaBek TROSPA oraz TROSPA-Salp15 pochodzcych z kleszcza pospolitego (I. ricinus) jako skBadnika szczepionki dla zwierzt przeciwko boreliozie. PrzeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca skierowane na biaBka TROSPA znacznie zmniejsz szanse zaka|enia nowych kleszczy poprzez zablokowanie lub utrudnienie oddziaBywania biaBka kleszczowego TROSPA z biaBkiem OspA krtka Borrelia burgdorferi sensu lato. OddziaBywanie to jest kluczowe dla procesu zasiedlenia kleszcza przez krtki. PrzeciwciaBa skierowane na biaBko TROSPA-Salp15 bd chroniBy krgowca przed zaka|eniem na etapie wnikania krtkw Borrelia poprzez niszczenie ochronnej otoczki utworzonej na ich powierzchni dziki oddziaBywaniu kleszczowego biaBka Salp15 i krtkowego biaBka OspC. Szczepionka bazujca na kleszczowych biaBkach TROSPA oraz TROSPA-Salp15 mo|e by stosowana samodzielnie bdz w poBczeniu z rekombinowanymi biaBkami OspA i OspC krtkw Borrelia burgdorferi sensu lato. Kleszcze to paso|yty zewntrzne, |ywice si krwi krgowcw. W cigu swego cyklu |yciowego kleszcze |eruj na wielu |ywicielach. Stwarza to mo|liwo[ przenoszenia pomidzy tymi |ywicielami r|nych drobnoustrojw chorobotwrczych. PrzykBadem takiego drobnoustroju jest wywoBujcy borelioz krtek Borrelia burgdorferi. Krtek ten zasiedla kleszcze w stadium larwy lub nimfy, podczas ich |erowania na zaka|onym krgowcu. Grupa zwierzt, bdcych kompetentnymi gospodarzami krtka (tzn. zwierzta u ktrych infekcja utrzymuje si na staBe), stanowi naturalny rezerwuar B. burgdorferi. Do grupy tej nale| gryzonie i inne drobne ssaki oraz ptaki (1, 2, 3, 4, 5), natomiast ludzie i zwierzta hodowlane s przypadkowymi gospodarzami dla B. burgdorferi. W cigu ostatniej dekady w Polsce i w Europie nastpiB gwaBtowny wzrost zapadalno[ci na borelioz. Dane ZakBadu Epidemiologii PaDstwowego ZakBadu Higieny, dotyczce ludno[ci polskiej s alarmujce, pokazuj bowiem dziesiciokrotny wzrost liczby przypadkw tej choroby na przestrzeni ostatniej dekady, z okoBo 2 do 20 przypadkw na 100000 osb (Figura 1 - wykres 1). Podobne zjawisko mo|na zaobserwowa w pozostaBych krajach europejskich. Borelioza nie jest zwykle chorob [mierteln, jednak jako[ |ycia cierpicych na ni osb jest znacznie ni|sza ni| ta odczuwana przez chorych na cukrzyce, choroby serca, depresje, chorob zwyrodnieniow staww lubchorob reumatoidaln. Borelioza wywiera tak|e wyniszczajcy wpByw na zwierzta domowe i hodowlane, powodujc straty wrolnictwie. W zwizku ze wzrastajc liczb zaka|eD krtkami B. burgdorferi rodzi si konieczno[ zapobiegania dalszemu rozprzestrzenianiu si tego groznego patogenu. Obecnie najcz[ciej stosowan droga prewencji boreliozy na [wiecie, a jedyn w Polsce, jest edukacja osb nara|onych na kontakty z kleszczami. Polega ona gBwnie na zachcaniu do stosowania odzie|y ochronnej czy preparatw odstraszajcych kleszcze oraz instruowaniu, jak postpowa w wypadku ukszenia. Jednak|e wedBug danych z USA, skuteczno[ stosowania odzie|y ochronnej wynosi 40% a skuteczno[ preparatw odstraszajcych kleszcze wynosi 20% (6, 7, 8). Szczepienia ochronne dla ludzi i zwierzt mogByby stanowi skuteczn metod prewencji boreliozy. W USA i w Europie podejmuje si prby stworzenia szczepionek ochronnych. Jedyn szczepionk, dopuszczon do III fazy testw klinicznych i nastpnie zatwierdzon przez FDA byB preparat pod nazw Lymerix, ktry zostaB wprowadzony do obrotu w USA w 1998 roku (9, 10, 11). Aktywnym skBadnikiem tej szczepionki byBo rekombinowane biaBko powierzchniowe OspA B. burgdorferi sensu stricto. PrzeciwciaBa skierowane na OspA neutralizuj bakterie obecne w jelicie kleszcza, zapobiegajc w ten sposb zaka|eniu czBowieka. Jednak|e w 2002 roku szczepionka ta zostaBa wycofana z obiegu przez wytwrc. Jako powody tej decyzji wymieniano maBy popyt, wysok cen oraz niepo|dane efekty uboczne typu reumatologicznego (arthralgia), ktre pojawiaBy si u nielicznych osb po zastosowaniu preparatu Lymerix. Ewentualne efekty uboczne wizano z faktem, i| w biaBku OspA wystpuje antygen homologiczny do ludzkiego antygenu LFA-1 (Lymphocyte function-associated antigen 1) co w przypadku immunizacji biaBkiem OspA mo|e prowadzi do reakcji autoimmunologicznej organizmu (12, 13, 14). Szczepionka bazujca na OspA podawana w trzech dawkach wykazywaBa stosunkowo wysok skuteczno[ 79% w III fazie testw klinicznych (11). W USA nadal dostpne s szczepionki oparte o rekombinowane biaBko OspA przeznaczone dla zwierzt domowych (15). Bardziej kompleksowe podej[cie do walki z borelioz mogBoby polega na ograniczeniu zaka|eD B. burgdorferi w[rd dzikich zwierzt, bdcych rezerwuarem krtka poprzez prowadzenie szczepieD ochronnych. W jednej z grup badawczych w USA pracuje nad szczepionk dla dzikich zwierzt opart o biaBko OspA z wykorzystaniem wirusa Vaccinia, analogicznie jak ma to miejsce w przypadku szczepionek przeciwko w[ciekliznie. Przygotowano preparat w formie karmy, zawierajcy nieszkodliwego zmodyfikowanego wirusa Vaccinia nioscego w swym DNA gen kodujcy OspA. Wykazano, |e u myszy ktre spo|yBy preparat, dochodziBo do ekspresji genw wirusa oraz biaBka OspA. Obecno[ OspA w organizmie myszy prowadziBa do powstawania przeciwciaB anty-OspA na takim poziomie, jaki w warunkach laboratoryjnych dawaB skuteczn ochron przed zaka|eniem B. burgdorferi (16). Prewencj boreliozy w Europie komplikuje fakt, |e szczepionki przeciwko B. burgdorferi produkowane w USA bazujce na jej biaBkach powierzchniowych, s w Europie nieskuteczne. Spowodowane jest to r|nicami serologicznymi pomidzy szczepami bakterii wystpujcymi w r|nych rejonach geograficznych [wiata. Wynikaj one z faktu, |e biaBka powierzchniowe B. burgdorferi kodowane s przez plazmidowy DNA, ktry wykazuje ogromn zmienno[. Dlatego wci| poszukuje si rozwizaD, ktre stanowiByby alternatyw w stosunku do tworzenia szczepionek opartych o powierzchniowe biaBka krtka. W ostatnim czasie pojawiBa si interesujca publikacja, w ktrej opisano wBa[ciwo[ci ochronne biaBka kleszczowego Salp15 (17). BiaBko Salp15 wystpuje w [linie kleszcza. OddziaBuje ono z powierzchniowym biaBkiem OspC B. burgdorferi, tworzc na powierzchni bakterii ochronn otoczk, ktra utrudnia rozpoznanie bakterii przez ukBad immunologiczny zaka|anego krgowca. Zwierzta laboratoryjne immunizowane rekombinowanym biaBkiem Salp15 wykazywaBy znaczc odporno[ na zaka|enie B. burgdorferi. Pokazano tak|e, |e wzbogacenie biaBkiem Salp15 skBadu wcze[niej opracowanych szczepionek bazujcych na rekombinowanych biaBkach powierzchniowych OspA i OspC znaczco poprawiaBo skuteczno[ ochrony przez zaka|eniem krtkiem. Prace badawcze majce na celu uzyskanie szczepionki chronicej ludzi przed zaka|eniem B. burgdorferi nadal s intensywnie prowadzone. Patent US2007020286 (A1) opisuje rekombinowane chimeryczne biaBko bdce kombinacj antygenw OspA i OspC B. burgdorferi jako potencjaln szczepionk przeciwko boreliozie. W rozwizaniu przedstawiono nowe chimeryczne kwasy nukleinowe, kodujce chimeryczne biaBko OspC Borrelia lub jego fragment antygenowy i chimeryczne biaBko OspA lub jego fragment antygenowy. Przedstawiono tak|e biaBka chimeryczne kodowane przez sekwencje kwasw nukleinowych. BiaBka chimeryczne mog by wykorzystane jako immunogeny szczepionki przeciwko boreliozie, jak i do reagentw immunodiagnostycznych. Patent US2012020973 (A1) opisuje rekombinowane chimeryczne biaBko bdce kombinacj antygenw biaBek OspA pochodzcych z r|nych gatunkw Borrelia burgdorferi sensu lato jako potencjaln szczepionk przeciwko boreliozie. Wynalazek dotyczy czsteczek chimerycznego biaBka OspA majcych zastosowanie w nowych szczepionkach przeciwko chorobie z Lyme. Bardziej szczegBowo, chimeryczne biaBka OspA zawieraj cz[ proksymaln z jednego serotypu OspA, wraz z cz[ci dystaln z innego serotypu OspA, przy jednoczesnym zachowaniu wBa[ciwo[ci antygenowych obydwu biaBek wyj[ciowych. Chimeryczne czsteczki OspA s dostarczane pojedynczo lub w poBczeniu, tak by zapewni ochron przeciwko r|norodnym szczepom Borrelia. W rozwizaniu przedstawiono tak|e sposoby dostarczania chimerycznych czsteczek OspA do obiektu, ktry ma by chroniony i leczony w przypadku choroby z Lyme lub boreliozy. Patent WO2008063240 (A2) opisuje przygotowanie szczepionki z wykorzystaniem bakterii Lactobacillus, produkujcej biaBko OspA Borrelia burgdorferi. Wynalazek dotyczy bakterii Lactobacillus, w ktrej 1) ekspresjonowany jest rekombinowany polipeptyd zawierajcy sekwencj sygnaBow lipoproteiny z biaBka OspA Borrelia burgdorferi lub aktywny wariant sekwencji liderowej, przyBczony do jednego lub wicej wskazanych polipeptydw heterologicznych i/lub 2) zawiera podlegajcy ekspresji polinukleotyd kodujcy rekombinowany polipeptyd zawierajcy sygnaB lipoproteiny z biaBka OspA Borrelia burgdorferi lub jego aktywny wariant, przyBczony do jednego lub wicej wskazanych polipeptydw heterologicznych. W jednym z rozwizaD wedBug wynalazku heterologiczny polipeptyd pochodzi z Yersinia pestis (paBeczki d|umy), czynnika etiologicznego d|umy. W innym rozwizaniu heterologiczny polipeptyd pochodzi z Borrelia burgdorferi, czynnika etiologicznego choroby z Lyme. Opisano tak|e kompozycje immunogenne, takie jak szczepionki z |ywymi bakteriami zawierajcymi bakterie; sposoby pozyskiwania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw polipeptydom i zestawy zawierajce bakterie. Patent CZ301244 (B6) opisuje przygotowanie preparatu szczepionkowego na bazie lizatu z Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii i Borrelia garinii. W wynalazku przedstawiono szczepionk oglnego zastosowania do leczenia i profilaktyki boreliozy dla ludzi i zwierzt, opartej na: bakterynach utworzonych na bazie caBych komrek, lizatw bakteryjnych lub oczyszczonych preparatw z trzech najbardziej patogennych gatunkw genomowych Borrelia wybranych spo[rd: Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii i Borrelia garinii, zawierajc co najmniej jedno immunogenne biaBko ochronne z bBony zewntrznej, zarwno OspA lub OspC, lub jednocze[nie immunogenne biaBka ochronne z bBony zewntrznej OspA i OspC lub inne immunogenne biaBka ochronne z bBony zewntrznej. Ujawniono tak|e sposb wytwarzania opisanej powy|ej szczepionki. Patent US2003138868 opisuje szereg czynnikw pochodzcych z Borrelia burgdorferi sensu lato, ktre maj potencjalne znaczenie dla prewencji boreliozy. Rozwizanie dotyczy czynnika do diagnostyki i/lub leczenia choroby z Lyme, ktry zawiera antygeny dehydrogenazy aldehydu- 3-fosfoglicerynowego (GAPDH), oligopeptydu permeazy, oligopeptydu ABC transportera peryplazmatycznego BP(oppA-2)(Bb), homologu transferazy glikozylowej IgtD, biaBka szoku cieplnego 90, fragmentu VLSE, domniemanej kasety (U76406) v1s rec. cV1s6 Borrelia burgdorferi, biaBka flageliny Borrelia garinii, (AE001578) hipotetycznego biaBka konserwatywnego cp32-6 Borrelia burgdorferi, prekursora p66 biaBka zwizanego z bBon Borrelia burgdoferii, BP (oppA-4)(Bc) periplazmatycznego transportera oligopeptydu ABC, aldozy fruktozo-bifosforanu (fba) Borrelia burgdorferi, biaBka DNAK, biaBka szoku cieplnego 70 Borrelia burgdorferi, orfE Borrelia burgdorferi, prekursora biaBka powierzchniowego B Borrelia burgdorferi, dehydrogenazy L-mleczanu (ldh), genu P83/100 Borrelia burgdorferi, enolazy 2-fosfoglicerynianu Borrelia burgdorferi, biaBka flageliny Borrelia garinii, hipotetycznego biaBka BBE28 Borrelia burgdorferi, homologu (rpoA) polimerazy DNA zale|nej od RNA, biaBka P66 (fragment), flageliny (fragment), polimerazy DNA zale|nej od RNA, integralnego biaBka bBon zewntrznych p66, homologu kinazy pirogronianowej (pyk), kinazy fosfoglicerynianu (pgk) i/lub BBU28760 NID, i/lub ich fragmenty i/lub sekwencje kwasu nukleinowego kodujce wskazane antygeny i/lub wskazane fragmenty. Patent PL 169804 opisuje sposb wytwarzania szczepionki przeciw boreliozie na podstawie przeciwciaB swoistych dla biaBka OspA lub OspB Borrelia burgdorferi. Przedmiotem wynalazku jest szczepionka przeciw chorobie z Lyme, zawierajca jedno lub wicej przeciwciaB monoklonalnych swoistych dla antygenu 31 kD (OspA) lub dla antygenu 34 kD(Osp B) Borrelia burgdorferi, sposb otrzymywania szczepionki przez fuzj limfocytw lub komrek [ledziony z utworzeniem hybrydomy, ktra produkuje przeciwciaBo monoklonalne. Przedmiotem wynalazku jest rwnie| przeciwciaBo monoklonalne LA2 przeciw OspA, LA26.1 przeciw OspA, LA 25.1 przeciw OspB, LA 27.1 przeciw OspB, patogenny szczep B. burgdorferi ZS7, DSM 5527, antygen dajcy reakcj immunologiczn z przeciwciaBem przeciw OspA, przeciw OspB, rekombinant DNA i rekombinowany wektor, sposb otrzymywania antygenw, szczepionka do czynnego uodpornienia przeciw chorobie Lyme, sposb otrzymywania szczepionki przeciw chorobie Lyme za po[rednictwem uodpornionych zwierzt oraz sposb izolacji i rekultywacji patogennych komrek B. burgdorferi od immunodefektywnych zwierzt do[wiadczalnych. Pomimo, |e wyBoniono wiele biaBek  kandydatw do roli szczepionki przeciwko boreliozie, |adne inne biaBko krtka B. burgdorferi, poza wymienionym OspA, nie zostaBo do tej pory dopuszczone do III fazy badaD klinicznych (15). R|nice serologiczne pomidzy szczepami bakterii wystpujcymi w r|nych rejonach geograficznych [wiata, wynikajce z faktu, |e biaBka powierzchniowe B. burgdorferi kodowane s przez plazmidowy DNA, ktry wykazuje ogromn zmienno[ powoduj, |e wci| poszukuje si rozwizaD, ktre stanowiByby alternatyw w stosunku do tworzenia szczepionek opartych o powierzchniowe biaBka krtka. BiaBko TROSPA wystpuje na powierzchni przewodu pokarmowego kleszcza i uczestniczy w procesie zasiedlania roztocza przez krtki B. burgdorferi s. l. Ze strony krtka w oddziaBywaniu tym bierze udziaB biaBko powierzchniowe OspA (18). BiaBko Salp15 wystpuje w [linie kleszcza. OddziaBuje ono z powierzchniowym biaBkiem OspC B. burgdorferi s. l., tworzc na powierzchni bakterii ochronn otoczk, ktra utrudnia rozpoznanie bakterii przez ukBad immunologiczny zaka|anego krgowca (19). Zarwno biaBko TROSPA jak Salp15, cho pochodz od kleszcza, odgrywaj kluczowe role w dwch r|nych punktach cyklu |yciowego B. burgdorferi. PrzeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca skierowane na biaBko Salp15 bd chroniBy zwierz przed zaka|eniem na etapie wnikania krtkw poprzez niszczenie ochronnej otoczki utworzonej na powierzchni bakterii dziki oddziaBywaniu Salp15  OspC. Zwierzta laboratoryjne immunizowane rekombinowanym biaBkiem Salp15 wykazywaBy znaczc odporno[ na zaka|enie B. burgdorferi. Pokazano tak|e, |e wzbogacenie biaBkiem Salp15 skBadu wcze[niej opracowanych szczepionek bazujcych na rekombinowanych biaBkach powierzchniowych OspA i OspC znaczco poprawiaBo skuteczno[ ochrony przez zaka|eniem krtkiem (20). Celem wynalazku jest dostarczenie szczepionki zawierajcej w swym skBadzie biaBka TROSPA i TROSPA-Salp15, ktre posiadaj wBa[ciwo[ci immunogenne. PrzeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca skierowane na biaBka TROSPA znacznie zmniejsz szanse zaka|enia nowych kleszczy poprzez zablokowanie lub utrudnienie oddziaBywania TROSPA - OspA. W ten sposb ograniczony zostanie naturalny rezerwuar bakterii, czego konsekwencj bdzie zmniejszona zapadalno[ na borelioz w[rd ludzi i zwierzt. Ponadto, przeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca, skierowane na antygen Salp15 obecny w biaBku fuzyjnym TROSPA-Salp15 bd chroniBy zwierz przed zaka|eniem na etapie wnikania krtkw poprzez niszczenie ochronnej otoczki utworzonej na powierzchni bakterii dziki oddziaBywaniu Salp15  OspC. Szczepionka bazujca na kleszczowych biaBkach TROSPA oraz TROSPA-Salp15 mo|e by stosowana samodzielnie bdz w poBczeniu z biaBkami OspA i OspC krtkw Borrelia burgdorferi sensu lato. Nieoczekiwanie okazaBo si, |e mo|liwe staBo si uzyskanie szczepionki zawierajcej w swym skBadzie rekombinowane biaBka TROSPA i TROSPA-Salp15, ktre posiadaj wBa[ciwo[ci immunogenne. Przedmiotem wynalazku jest szczepionka przeciw boreliozie bazujca na kleszczowych biaBkach TROSPA oraz TROSPA-Salp15, charakteryzujca si tym, |e zawiera rekombinowane biaBko TROSPA okre[lone sekwencj SEQ. nr 3 lub rekombinowane biaBko TROSPA-Salp15 okre[lone sekwencj SEQ. ID nr 4. Korzystnie, gdy szczepionka zawiera biaBko bdce produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA okre[lonego sekwencj SEQ. nr 1 lub rekombinowane biaBko bdce produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15 okre[lonego sekwencj SEQ. nr 2. Korzystnie, gdy rekombinowane biaBko TROSPA i/lub TROSPA-Salp15 posiada wBa[ciwo[ci immunogenne. Korzystnie, gdy szczepionka jest stosowana samodzielnie lub w poBczeniu z biaBkami OspA i OspC krtkw Borrelia burgdorferi sensu lato. Korzystnie, gdy szczepionka zawiera preparat biaBek rekombinowanych TROSPA z Ixodes ricinus oraz OspA i OspC z Borrelia burgdorferi sensu lato. Korzystnie, gdy chroni zwierz przed zaka|eniem na etapie wnikania krtkw. Korzystnie, gdy przeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca oddziaBuj z biaBkiem TROSPA w jelicie Ixodes ricinus. Korzystnie, gdy przeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca skierowane na biaBka Salp15 oddziaBuj z ochronn otoczk utworzonej na powierzchni bakterii przez oddziaBywanie Salp15  OspC. Korzystnie, gdy przeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca skierowane na biaBka TROSPA blokuj lub utrudniaj oddziaBywania TROSPA  OspA, za[ przeciwciaBa skierowane na antygen Salp15 obecny w biaBku fuzyjnym TROSPA-Salp15 chroni zwierz przed zaka|eniem na etapie wnikania krtkw niszczc ochronn otoczk utworzon na powierzchni bakterii poprzez oddziaBywanie Salp15  OspC. Korzystnie, gdy przeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca skierowane na biaBka TROSPA zmniejszaj szanse zaka|enia nowych kleszczy Ixodes ricinus. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest konstrukt genetyczny TROSPA, charakteryzujcy si tym, |e stanowi sekwencj SEQ. ID nr 1. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest konstrukt genetyczny TROSPA-Salp15, charakteryzujcy si tym, |e stanowi sekwencj SEQ. ID nr 2. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest rekombinowane biaBko TROSPA bdce produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA, charakteryzujce si tym, |e posiada sekwencj SEQ. ID nr 3. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest rekombinowane biaBko TROSPA-Salp15 bdce produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15, charakteryzujce si tym, |e posiada sekwencj SEQ. nr 4. Korzystnie, gdy rekombinowane biaBko posiada wBa[ciwo[ci immunogenne. Korzystnie, gdy rekombinowane biaBka opisane powy|ej oddziaBuj z biaBkiem OspA z Borrelia burgdorferi sensu lato. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposb otrzymywania konstruktu genetycznego TROSPA okre[lonego powy|ej charakteryzujcy si tym, |e amplifikuje si gen kodujcy biaBko TROSPA I. ricinus metod PCR na podstawie DNA wyizolowanego z I. ricinus ze starterami o sekwencji SEQ. ID nr 5 i SEQ. ID nr 6, a nastpnie poddaje si go skBadaniu (splicingowi) w komrkach ro[linnych, po czym amplifikuje si uzyskany mRNA TROSPA metod odwrotnej transkrypcji i PCR za pomoc starterw o sekwencji SEQ. ID nr 7 i SEQ. ID nr 8, a nastpnie klonuje si w wektorze pET200/D-TOPO. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposb otrzymywania konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15 okre[lonego powy|ej charakteryzujcy si tym, |e syntezuje si DNA na podstawie konstruktu genetycznego okre[lonego SEQ. ID nr 1 oraz sekwencji kodujcej biaBko Salp15 Iric-1 (gb EU128526.1), zoptymalizowanej w kierunku ekspresji w ukBadzie bakteryjnym, a nastpnie uzyskan sekwencj DNA TROSPA-Salp15 okre[lon SEQ. ID nr 2 amplifikuje metod PCR ze starterami FUS11Af okre[lonym SEQ. ID nr 9 i FUS11Ar okre[lonym SEQ. ID nr 10, a nastpnie klonuje si w wektorze pET200/D-TOPO. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposb otrzymywania szczepionki okre[lonej powy|ej, charakteryzujcy si tym, |e prowadzi si ekspresj konstruktu genetycznego okre[lonego SEQ. ID nr 1 lub SEQ. ID nr 2 w E. coli. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposb otrzymywania rekombinowanych biaBek okre[lonych powy|ej, charakteryzujcy si tym, |e prowadzi si ekspresj konstruktu genetycznego SEQ. ID nr 1 lub SEQ. ID nr 2 w E. coli. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie rekombinowanych biaBek TROSPA oraz TROSPA-Salp15 okre[lonych powy|ej pochodzcych z kleszcza pospolitego (I. ricinus) do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie do immunizacji zwierzt. Korzystnie, gdy preparat zawierajcy oczyszczone rekombinowane biaBko TROSPA o sekwencji SEQ. nr 3 podawany jest do|ylnie. Korzystnie, gdy preparat zawierajcy oczyszczone rekombinowane biaBko o sekwencj SEQ. nr 3 lub SEQ. nr 4 podawany jest doustnie. Korzystnie, gdy preparat zawierajcy oczyszczone rekombinowane biaBka o sekwencji SEQ. nr 3 oraz rekombinowane biaBka OspA i OspC z Borrelia burgdorferi sensu lato podawany jest doustnie. Figura 1 przedstawia wykres obrazujcy zapadalno[ na borelioz wg danych Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego. W celu lepszego zrozumienia wynalazku rozwizanie przedstawiono na rysunku, gdzie: figura 2 przedstawia wybrane etapy tworzenia i ekspresji konstruktu genetycznego kodujcego rekombinowane biaBko TROSPA. A  rozdziaB elektroforetyczny DNA: gen TROSPA zamplifikowany metod PCR na podstawie DNA wyizolowanego z I. ricinus (g), cDNA TROSPA zamplifikowany z RNA wyizolowanego z N. benthamiana agroinfiltrowanego konstruktem zawierajcym gen TROSPA (c), marker wielko[ci (w). B  rozdziaB elektroforetyczny oczyszczonego rekombinowanego biaBka TROSPA otrzymanego w E. coli (T), marker wielko[ci (w). C  porwnanie sekwencji nukleotydowej GenBank EU034646.1. Ixodes ricinus TROSPA mRNA complete cds (gb|EU034646.1|) z konstruktem genetycznym kodujcym rekombinowane biaBko TROSPA (TROSPA). Konserwatywne nukleotydy oznaczono  * , niekonserwatywne nukleotydy oznaczono kursyw; figura 3 porwnanie sekwencji nukleotydowej konstruktu genetycznego kodujcego rekombinowane biaBko TROSPA-Salp15 oraz odpowiadajcych jej sekwencji Ixodes ricinus Salp15 Iric-1 mRNA, complete cds GenBank: EU128526.1 i Ixodes ricinus TROSPA mRNA, complete cds GenBank: EU034646.1.  * oznaczono nukleotydy identyczne pomidzy sekwencjami kodujcymi rekombinowane biaBko TROSPA-Salp15 oraz Ixodes ricinus TROSPA mRNA, complete cds GenBank: EU034646.1,  ^ oznaczono nukleotydy identyczne pomidzy sekwencjami kodujcymi rekombinowane biaBko TROSPA-Salp15 oraz Ixodes ricinus Salp15 Iric-1 mRNA, complete cds GenBank: EU128526.1; figura 4 przedstawia rozdziaB elektroforetyczny oczyszczonego rekombinowanego biaBka TROSPA-Salp15 otrzymanego w E. coli; figura 5 przedstawia sekwencje aminokwasowe rekombinowanych biaBek TROSPA (podkre[lono, wytBuszczono) oraz TROSPA-Salp15 (fragment kodujcy biaBkow etykiet pochodzc z pET200/D-TOPO wytBuszczono i oznaczono maBymi literami, fragment kodujcy sekwencj TROSPA podkre[lono i wytBuszczono, fragment kodujcy Salp15 podkre[lono i oznaczono kursyw, fragment Bczcy oznaczono kursyw, miejsce rozpoznawane przez proteaz TEV podkre[lono); figura 6 ukazuje wykres przedstawiajcy wpByw st|enia rekombinowanego biaBka OspA na wydajno[ tworzenia kompleksu pomidzy rekombinowanymi biaBkami TROSPA Ixodes ricinus i OspA z Borrelia burgdorferi; fig. 6A  tworzenie kompleksu TROSPA  OspA. OddziaBywanie badano na mikropBytce ELISA opBaszczonej rekombinowanym biaBkiem TROSPA i inkubowanej z seryjnymi rozcieDczeniami rekombinowanego biaBka OspA oraz biaBka kontrolnego (OspC z B. burgdorferi). Detekcji zwizanego biaBka dokonywano przy u|yciu komercyjnie dostpnych przeciwciaB pierwszorzdowych anty-Borrelia oraz drugorzdowych przeciwciaB sprz|onych z alkaliczn fosfataz, mierzc absorbancj produktu reakcji za pomoc fotometru Microplate Rider Model 550 firmy BIORAD; fig. 6B  porwnanie wydajno[ci tworzenia kompleksu pomidzy rekombinowanymi biaBkami TROSPA i OspA w obecno[ci surowicy krlika immunizowanego rekombinowanym biaBkiem TROSPA. Jako kontrol stosowano surowic krlika nieimmunizowanego. OddziaBywanie badano na mikropBytce ELISA opBaszczonej rekombinowanym biaBkiem TROSPA. PBytk inkubowano z seryjnymi rozcieDczeniami surowicy immunizowanego i nieimmunizowanego krlika, a nastpnie z rekombinowanym biaBkiem OspA o st|eniu 80 g/ml. Detekcji zwizanego rekombinowanego biaBka OspA dokonywano przy u|yciu przeciwciaB anty-Borrelia sprz|onych z FITC, mierzc fluorescencj przy pomocy aparatu VICTOR X4 2030 Multilabel Reader firmy PerkinElmer. figura 7 przedstawia analiz specyficzno[ci przeciwciaB anty-TROSPA powstaBych w surowicy krlikw po do|ylnej immunizacji preparatem rekombinowanego biaBka TROSPA. Zwierztom podawano preparat rekombinowanego biaBka TROSPA w dawce 100g, w czterech punktach czasowych: 0, 14, 28 i 56 dni. Surowice pobierano przed immunizacj (fig. 7A), a nastpnie po 38 (fig. 7B), 66 (fig. 7C) i 87 (fig. 7D) dniach po immunizacji. Obecno[ przeciwciaB w surowicy immunizowanych zwierzt stwierdzono metod Western-blot z zastosowaniem przeciwciaB anty-krliczych sprz|onych z alkaliczn fosfataz. T1  oczyszczone biaBko TROSPA, T2  lizat z bakterii produkujcych biaBo TROSPA, K  lizat z bakterii produkujcych inne biaBko (rekombinowane biaBko OspC z B. burgdorferi), M  marker masy; figura 8 przedstawia poziom IgG w surowicy szczurw immunizowanych rekombinowanymi biaBkami TROSPA, TROSPA-Salp15 lub TROSPA, OspA i OspC; fig. 8A - mikropBytk opBaszczon rekombinowanym biaBkiem TROSPA inkubowano z rosncymi rozcieDczeniami surowicy zwierzt immunizowanych przez do|oBdkowe podanie preparatu rekombinowanego biaBka TROSPA lub TROSPA-Salp15; fig. 8B - mikropBytk opBaszczon rekombinowanym biaBkiem Salp15 inkubowano z rosncymi rozcieDczeniami surowicy zwierzt immunizowanych przez do|oBdkowe podanie preparatu biaBka TROSPA-Salp15; fig. 8C - mikropBytk opBaszczon jednym z rekombinowanych biaBek TROSPA, OspA lub OspC inkubowano z rosncymi rozcieDczeniami surowicy zwierzt immunizowanych przez do|oBdkowe podanie preparatu biaBka TROSPA OspA i OspC. Nastpnie dokonywano detekcji poziomu zwizanych IgG szczurzych przy pomocy komercyjnie dostpnych przeciwciaB anty-szczurzych sprz|onych z alkaliczn fosfataz. Na wykresie zaznaczono maksymalne rozcieDczenia surowic immunizowanych zwierzt, przy ktrych obserwowano statystycznie istotn r|nic w stosunku do grupy kontrolnej zwierzt immunizowanych samym adiuwantem. W celu lepszego zrozumienia rozwizania przedstawiono przykBadowe rozwizania wedBug wynalazku. PrzykBad 1 Produkcja rekombinowanych biaBek kleszczowych TROSPA okre[lonego sekwencj SEQ ID nr 3 i TROSPA-Salp15 okre[lonego sekwencj SEQ ID nr 4 oraz rekombinowanych biaBek OspA i OspC Borrelia burgdorferi sensu lato; badanie oddziaBywania pomidzy rekombinowanym biaBkiem kleszczowym TROSPA i rekombinowanym biaBkiem OspA Borrelia burgdorferi. Gen TROSPA zamplifikowano metod PCR na podstawie genomowego DNA wyizolowanego z I. ricinus zebranych na terenie kraju z zastosowaniem zestawu do izolacji DNA QIAamp DNA Mini Kit firmy QIAGEN. Do amplifikacji metod PCR u|ywano starterw TROSPAF i TROSPAR (Tabela 1) okre[lonych sekwencjami SEQ ID nr 5 i SEQ ID nr 6 , zaprojektowanych na podstawie sekwencji dostpnej w GenBank pod numerem EU034646.1. Poniewa| gen TROSPA zawiera jeden intron, nale|aBo podda go skBadaniu. W tym celu gen TROSPA sklonowano w wektorze binarnym pICH10990 firmy Icon Genetics i uzyskany konstrukt zastosowano do agroinfiltracji N. benthamiana wg zaleceD producenta. Nastpnie zamplifikowano cDNA trospa i sklonowano w wektorze ekspresyjnym typu pET z zastosowaniem starterw TROTOPF i TRORPST okre[lonych sekwencjami SEQ ID nr 7 i SEQ ID nr 8. Do klonowania i pzniejszej ekspresji rekombinowanego biaBka TROSPA okre[lonego sekwencj SEQ ID nr 3 u|ywano systemu Champion"! pET200 Directional TOPO Expression Kit with BL21 Star"! (DE3) One Shot (suplement 1), stosujc si do zaleceD producenta. Wskutek klonowania do wektora pET200/D-TOPO utworzony zostaB konstrukt genetyczny TROSPA okre[lony sekwencj SEQ ID nr 1 pokazany na figurze 2C, kodujcy rekombinowane biaBko TROSPA okre[lone sekwencj SEQ ID nr 3. Figura 2A i 2B pokazuje wybrane etapy tworzenia i ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA kodujcego rekombinowane biaBko TROSPA. Produkowane w w/w systemie bakteryjnym rekombinowane biaBko TROSPA okre[lone sekwencj SEQ ID nr 3 B D F H J L v  " $ D L P ^ z 6d&(zslslsdhr>h)6 hr>h) hr>hv6hr>hMwaJhr>hw6aJhr>hP0aJhr>hl]aJhr>hmLaJhr>h{aJhr>hwaJ hN3hN3 hN3aJhN3hwaJh hP0aJhLhN3h.5 hi25hN3hN35hN3hL5 h`H5&  H J  0&7LAdh7$8$H$`gdN$dh[$\$`a$gdLx$dh[$\$`a$gd  dh`gddhgd  dh`gd dhgdN3(246tvxX~ rz"$&(:<LNVp>xƽƶƶƶƶƶԯԶԶԦ{rl h aJh97qhwaJ h97qaJhr>h4]6aJhr>h4]aJhr>hFaJhr>haJhr>hOKaJ hr>he[ hr>h4]hr>h)aJ hr>h) hr>hrKU hr>hOK hr>hv6hr>h)6hr>h?6 hr>hzD hr>h?'Jf8<&6lz|~,HVvxNp t ҼҶҭzm`h h=*OJQJ^Jh h$ 8OJQJ^Jh hP0OJQJ^Jh hP0OJQJ]^J hM`]aJ hJ/]aJh h]aJh haJ haJ haJh hl2F6aJ hM`aJh hl2FaJh hR6aJh hRuaJh hcaJh hRaJ% !:!!v"x"""""##$$L$$$$$ %%n%%B&F&P&h&p&&&&&&&"(.(D(F(̞̿̿̿̿̿鑇zmzchWOJQJ^Jh hOJQJ^Jh h8DOJQJ^JhOJQJ^Jh h5xOJQJ^JhOJQJ^Jh,QUOJQJ^Jh hY7OJQJ^Jh h OJQJ^Jh h[}{OJQJ^Jh h=*6OJQJ]^Jh h=*OJQJ^JhM`OJQJ^J&F(\(b(r(((((((()) )>)@)+"+^+j+++++++,V-b-d--ܻܕ܈܈z܈܈m]h hi6OJQJ\^Jh hY7OJQJ^Jh hi6OJQJ^Jh hiOJQJ^Jhh=OJQJ^Jh h6OJQJ^Jh h5x6OJQJ^Jh h5xOJQJ^Jhi8OJQJ^JhyOJQJ^Jh hOJQJ^Jh h8DOJQJ^Jhs_#OJQJ^J-- .,.:.<.`.d.x.z..T/V/X/Z/^///////000(0*0d0f0ź񬟕si\sRsHsRs\hOJQJ^JhcOJQJ^Jh h8DOJQJ^JhDbOJQJ^Jh heOJQJ^JhDOJQJ^JhDbOJQJ\^Jh5LOJQJ^Jh hUk\OJQJ^Jh heOJQJ\^JhBOJQJ\^JhWOJQJ\^JhJ/OJQJ\^JhOJQJ\^JhL'OJQJ\^Jh hiOJQJ\^Jf0|0000000001B1^123"3t44x5567 7"7$7&7L7`7778888Ÿxxmd^dRd^d^h hN6]aJ hNaJh hNaJhN6OJQJ^JhP(hLx6OJQJ^JhM`OJQJ^JhDRhLx6OJQJ^Jh hLx6OJQJ]^JhLxOJQJ^Jh hLxOJQJ^Jh%=jhLxOJQJ^JhDROJQJ^Jh hxTOJQJ^JhDOJQJ^Jh heOJQJ^J 8889::;<<<`==j??HAJALANAAAAAAABXBZBBBB0CLCCCCʽʽyuynf_Wnh Bha6 h Bhah Bha6 h Bhah[c hhEhahaOJQJ^Jh%=jhxTOJQJ^Jh%=jhxT6OJQJ^Jh hxT6OJQJ^JhOJQJ^Jh hxTOJQJ^Jh9OJQJ^Jh,V?hN6aJh,V?hNaJh hN6aJ hNaJh hNaJ"LAZBFMW]irhwȈqaYdhgdzdh7$8$H$`gd'$dh[$\$`a$gd> dhxgd`H$dh[$\$`a$gdLx$dh[$\$`a$gdLx$dh[$\$`a$gd`H$dh[$\$`a$gd`H$dhx[$\$`a$gd`H CCCCDDDDD D&D.D0D2DBDXDZDdDhDjDtDDDDDDDDDDDD0ELEhErEEEEEEEFFF*FFFFFFFFFFG\GG HչhhEhWU6OJQJ^Jh[cOJQJ^JhhEhWUOJQJ^J h hhE h BhHd h Bh + h BhP h Bhjh BhhE6 h Bh[c h BhhE h BhF h BhlD9 H:H`T`V`X`v`x````````````aaaaB*\]phh hXBIB*\phh BhXBI5B*\phh BhhEB*phh BhhEB*ph h BhE@ h BhAr h Bh^ h BhP h BhU6pjjj kkkkklllooo2op p(r,r.rDrrrrs@ssԳԠ|ԠkaTaGh,V?h>OJQJ^Jh%=jh>OJQJ^Jh>OJQJ^J!h BhXBIaJfHq !h3*h];aJfHq $h3*h3*6aJfHq $h3*hhE6aJfHq h3*6aJfHq !h3*hT aJfHq !h3*hhEaJfHq h3*h<>6\h h<>\h hXBI\sshtjtttvttttOJQJ^Jh,V?h>OJQJ^Jh,V?h>6OJQJ^J36BD܅BTƈȈ8<>@vx.VJlڿsbsbsbsbsb!hjhjB*OJQJ^JphhjB*OJQJ^Jph!hjhB*OJQJ^Jph!h`Hhv6B*OJQJ^Jphh`HB*OJQJ^JphhUxB*OJQJ^Jph!h`Hh`HB*OJQJ^Jphhr>hz6aJhr>hzaJ hr>hz h hxephxephv6 h hv6!Ȉ@J^\pXȣP$dh[$\$a$gdj$dh[$\$`a$gdj$dhx[$\$`a$gdjZ^~<z: 2ʗĘ0h,r6 \npڞVX,.VҠ,@ȣ֤P(NȪ̪hjB*OJQJ^Jph!hjhjB*OJQJ^Jph$hjhj6B*OJQJ^JphQ|ް"&(BfZ\yyuqum_Rh:ghn!OJQJ^Jhn hn!5OJQJ^Jhn!hALhJh BOJQJ^Jhn!h BOJQJ^Jhn!h B5OJQJ^Jh B5OJQJ^J$hjh B5B*OJQJ^Jph!hjhJ/B*OJQJ^Jph$hjhj6B*OJQJ^JphhjB*OJQJ^Jph!hjhjB*OJQJ^Jph ظ"Tljs$dhx[$\$`a$gd`H$dh[$\$`a$gd1u$dh[$\$`a$gdn! dh7$8$H$gd/$dhx[$\$`a$gd B$dh[$\$`a$gd B$dh[$\$a$gdj زrLdhx$@ȷʷطܷ*DzԸָظڸ0`nϷϩϟϟϷϷϐυwm``h%M`h%M`OJQJ^Jhn!OJQJ^Jhn!hn!5OJQJ^Jhn!5OJQJ^Jh%M`OJQJ^J hL5h;uROJQJ^Jh<$h:g6OJQJ^Jh#aOJQJ^Jh:gh:g6OJQJ^Jh:gh:gOJQJ^Jh&uh&uOJQJ^Jhn hn OJQJ^Jhn OJQJ^J%npt ^d6R½νн :<\fhľƾߺvvl^hmFhn!6OJQJ^Jh#aOJQJ^Jh# OJQJ^JhTOJQJ^Jhn!OJQJ^Jhn!hn!5OJQJ^Jhn!5OJQJ^Jh%M`hn!OJQJ^Jh%M`OJQJ^Jh];h%M`OJQJ^Jhuh%M`6OJQJ^Jh%M`h%M`OJQJ^Jh;uROJQJ^JhuOJQJ^J"ƾȾ ,L~( "$024>BFr <LZ\⴩zpfzXh% vh% v6OJQJ^Jh+OJQJ^Jh5}2OJQJ^Jh;hn!OJQJ^Jh#aOJQJ^Jh3iOJQJ^Jhn!hn!5OJQJ^Jhn!5OJQJ^Jhn!OJQJ^JhPhkOJQJ^Jh^OJQJ^Jhl?hkOJQJ^JhkOJQJ^JhaOJQJ^Jhv6OJQJ^J\xz|Xvxz~2:>T еДДДДДД|ДnЫСh) hn!6OJQJ^Jh;hn!6OJQJ^JhqOJQJ^Jh hn!OJQJ^JhvOJQJ^Jh`HOJQJ^Jh;hn!OJQJ^Jhn!hn!5OJQJ^Jhn!OJQJ^Jh% vOJQJ^Jh;h% vOJQJ^JhHh% v6OJQJ^J(  "&(FdtJh nTVbd~ J`ѺѺѺǺѺѺѰѺћۃyyyoh+OJQJ^JhmOJQJ^Jh1uOJQJ^Jhn!hn!5OJQJ^Jhn!5OJQJ^Jh?7OJQJ^Jh<OJQJ^Jh hn!OJQJ^JhqOJQJ^Jhn!OJQJ^JhvOJQJ^Jh% vhv6OJQJ^Jh;hvOJQJ^J* .<JZh&BDjlnz||qcqYLLh&]]h1uOJQJ^Jhn!OJQJ^Jhn!hn!5OJQJ^Jhn!5OJQJ^Jh1u5OJQJ^Jh1u6OJQJ^Jh;h1u6OJQJ^Jh1uOJQJ^Jh93N0JOJQJ^JhKW0JOJQJ^Jhe`h1u0J5OJQJ^Jh#a0JOJQJ^JhmOJQJ^Jhm0JOJQJ^Jh1u0JOJQJ^J"02NdfP`b>JLPRTfh~ N48DFHtƼѤѤhs=1h1u5OJQJ^JhKWOJQJ^JhJOJQJ^Jh1u5OJQJ^Jhe`h1u5OJQJ^JhOOJQJ^Jh&]]h1uOJQJ^Jh1uOJQJ^J@hj,.BDXxT`ǼwlwbUKheOJQJ^Jh heOJQJ^Jhd1gOJQJ^JhMK6OJQJ^Jhz 6OJQJ^Jh[6OJQJ^Jh !6OJQJ^Jh t6OJQJ^JhKhK6OJQJ^Jhn!5OJQJ^JhK5OJQJ^JhI5OJQJ^JhOJQJ^Jhn!hn!OJQJ^Jh&]]h1uOJQJ^Jh1uOJQJ^Jj,.D9EGTRbbc"cPc$dh$If[$\$a$gd8x`dhgde$dh[$\$`a$gdedhgdpdhgdH$dhx[$\$a$gdI$dh[$\$a$gdI$dhx[$\$`a$gd`H J` $&22>BXVZ监瑃uuhh[hJhJOJQJ^Jh-lheOJQJ^Jhbzhe6OJQJ^Jh\1!h\1!6OJQJ^Jh\1!OJQJ^Jh\1!h\1!OJQJ^Jh !OJQJ^JhKiheOJQJ^Jh{WheOJQJ^JhAYhe6OJQJ^Jh heOJQJ^JheOJQJ^Jh{Whe6OJQJ^J$&FPvz*@Br|~ Ȼȱȧ|o|e|oe[h|OJQJ^Jh}^OJQJ^Jh,hX~OJQJ^JhX~OJQJ^Jh;uROJQJ^JhPhLOJQJ^Jh 0OJQJ^JhLOJQJ^JhSOJQJ^JhUheOJQJ^JheOJQJ^Jh,heOJQJ^Jh,h,OJQJ^Jh,OJQJ^JhJOJQJ^J# .0L^x666:7j7777777Ϊ|obo|V|hF0JOJQJ^Jh*S0J6OJQJ^JhF0J6OJQJ^JhglhF0J6OJQJ^JhW,hF0JOJQJ^JhW,hFOJQJ^JUh,hX~OJQJ^JhFOJQJ^Jh heOJQJ^JhX~OJQJ^Jh}^OJQJ^JhpVOJQJ^Jh|OJQJ^JheOJQJ^Jzaopatrzone zostaBo w znacznik HIS dodany do jego koDca N (suplement 1), co umo|liwiBo oczyszczanie biaBka przy u|yciu chromatografii powinowactwa za pomoc kolumny niklowej. Elucji rekombinowanego biaBka TROSPA dokonywano przy 200 mM st|eniu imidazolu. Obraz rozdziaBu elektroforetycznego oczyszczonego w ten sposb biaBka TROSPA przedstawiono na figurze 2B. Preparat dializowano w buforze 1x PBS. Figura 5 pokazuje sekwencj aminokwasow rekombinowanego biaBka TROSPA. Sekwencj DNA TROSPA-Salp15 uzyskano poprzez syntez DNA na podstawie sklonowanej sekwencji kodujcej rekombinowane biaBko TROSPA oraz sekwencji kodujcej biaBko Salp15 Iric-1, opublikowanej w GenBank pod numerem EU128526.1, ktra zostaBa zoptymalizowana w kierunku ekspresji w ukBadzie bakteryjnym. Sekwencje nukleotydow konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15 kodujcego rekombinowane biaBko TROSPA-Salp15 oraz porwnanie odpowiednich jego fragmentw sekwencjami EU034646.1 i EU128526.1 przedstawiono na figurze 3. Sekwencj DNA TROSPA-Salp15 amplifikowano metod PCR ze starterami FUS11Af i FUS11Ar okre[lonymi sekwencjami SEQ ID nr 9 i SEQ ID nr 10. Nastpnie klonowano i przeprowadzono ekspresj konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15 okre[lonego sekwencj SEQ nr 2 z u|yciem systemu Champion"! pET200 Directional TOPO Expression Kit with BL21 Star"! (DE3) One Shot (suplement 1), stosujc si do zaleceD producenta, uzyskujc rekombinowane biaBko TROSPA-Salp15 okre[lone sekwencj SEQ ID nr 4. BiaBko to nie wizaBo si do kolumny niklowej, pomimo obecno[ci znacznika HIS obecnego na jego koDcu N (suplement 1). Oczyszczony preparat rekombinowanego biaBka TROSPA-Salp15 uzyskano za pomoc chromatografii jonowymiennej z zastosowaniem zBo|a DEAE-celulozowego. Elucji rekombinowanego biaBka TROSPA-Salp15 dokonywano przy 200 mM st|eniu NaCl. Obraz rozdziaBu elektroforetycznego oczyszczonego w ten sposb rekombinowanego biaBka TROSPA-Salp15 przedstawiono na figurze 4. Preparat biaBka dializowano w buforze 1x PBS. Sekwencje aminokwasowe rekombinowanych biaBek TROSPA i TROSPA-Salp15 pokazano na figurze 5. Poprawno[ sekwencji aminokwasowej rekombinowanych biaBek TROSPA i TROSPA-Salp15 produkowanych w E. coli potwierdzono metod spektrometrii mas (spektrometr MALDI-TOF). Sekwencje kodujce biaBka OspA i OspC Borrelia burgdorferi sensu lato (dokBadnie: B. garinii, B. afzelii i B. burgdorferi sensu stricto) zamplifikowano metod PCR na podstawie DNA wyizolowanego z I. ricinus zebranych na terenie kraju z zastosowaniem zestawu do izolacji DNA QIAamp DNA Mini Kit firmy QIAGEN. Do amplifikacji metod PCR u|ywano par starterw OspAf/OspAr i OspCf/OspCr (Tabela 1), zaprojektowanych na podstawie sekwencji dostpnych w GenBank: B. garinii ospA gene GenBank: X85441.1, Borrelia garinii gene for outer surface protein C, complete cds GenBank: D49498.1. Zamplifikowany DNA kodujcy biaBka OspA i OspC (B. garinii, B. afzelii i B. burgdorferi sensu stricto) sklonowano i poddano ekspresji w systemie Champion"! pET200 Directional TOPO Expression Kit with BL21 Star"! (DE3) One Shot, stosujc si do zaleceD producenta. W ten sposb otrzymano rekombinowane biaBka OspA i OspC Borrelia burgdorferi sensu lato, zaopatrzone w biaBkow etykiet na koDcu N (suplement 1), co umo|liwiBo ich oczyszczanie przy u|yciu chromatografii powinowactwa za pomoc kolumny niklowej. Elucji rekombinowanych biaBek OspA i OspC dokonywano przy 200 mM st|eniu imidazolu. Preparaty dializowano w buforze 1x PBS. Sekwencje aminokwasowe rekombinowanych biaBek OspA i OspC Borrelia burgdorferi sensu lato potwierdzono metod spektrometrii mas (spektrometr MALDI-TOF). Ponadto okre[lono, i| rekombinowane biaBko TROSPA okre[lone sekwencj SEQ nr ID 3 i rekombinowane biaBko OspA zachowaBy naturaln zdolno[ do tworzenia kompleksu TROSPA  OspA. Fakt ten zostaB potwierdzony poprzez analiz oddziaBywaD metod ELISA. MikropBytk ELISA opBaszczano rekombinowanym biaBkiem TROSPA poprzez inkubacj roztworu biaBka o st|eniu 5 g/ml w buforze PBST. Nastpnie pBytk pBukano piciokrotnie buforem PBSTT i blokowano poprzez inkubacj w 2% roztworze BSA w buforze PBSTT. Po zablokowaniu, pBytk pBukano piciokrotnie buforem PBSTT i inkubowano z seryjnymi rozcieDczeniami rekombinowanego biaBka OspA oraz kontroli. Detekcji zwizanego biaBka dokonywano przy u|yciu komercyjnie dostpnych przeciwciaB pierwszorzdowych anty-Borrelia oraz drugorzdowych przeciwciaB sprz|onych z alkaliczn fosfataz. Nastpnie porwnano siB oddziaBywania pomidzy rekombinowanymi biaBkami TROSPA i OspA w obecno[ci surowicy krlika immunizowanego rekombinowanym biaBkiem TROSPA, jako kontrol stosowano surowic krlika nieimmunizowanego. W tym celu mikropBytk ELISA opBaszczano rekombinowanym biaBkiem TROSPA poprzez inkubacj roztworu biaBka o st|eniu 5 g/ml w buforze PBSTT. Nastpnie pBytk pBukano piciokrotnie buforem PBSTT i blokowano poprzez inkubacj w 2% roztworze BSA w buforze PBSTT. Po zablokowaniu pBytk pBukano piciokrotnie buforem PBSTT i inkubowano z seryjnymi rozcieDczeniami biaBka surowicy krlika immunizowanego biaBkiem TROSPA lub surowicy krlika nieimmunizowanego. Nastpnie pBytk pBukano piciokrotnie buforem PBSTT i inkubowano z rekombinowanym biaBkiem OspA o st|eniu okoBo 80 g/ml. Detekcji zwizanego rekombinowanego biaBka OspA dokonywano przy u|yciu komercyjnie dostpnych przeciwciaB anty-Borrelia sprz|onych z FITC. Wyniki eksperymentu, przedstawione na figurze 6B, potwierdziBy zdolno[ do tworzenia kompleksu pomidzy rekombinowanym biaBkiem TROSPA okre[lonego sekwencj SEQ ID nr 3 oraz rekombinowanym biaBkiem OspA. Potwierdzono tak|e zdolno[ zaburzania tego oddziaBywania przez przeciwciaBa anty-TROSPA (figura 6A). Tabela 1. Sekwencje nukleotydowe starterw do reakcji PCR. nazwa starterasekwencja nukleotydowaTROSPAFTTTGGTCTCAAGGTATGGCGGCTATGGAGGCTROSPARATATTTAAATTCAACTTCCAGCGGCGCTROTOPFCACCATGGCGGCTATGGAGGCTRORPSTATCTGCAGTCAACTTCCAGCGGCGCTCTGGTCGGFUS11AfCACCATGGCGGCTATGGAGGCTATGGCGGFUS11ArATGGATCCTTAACAACCCGGAATATGACCAOspAfCACCATGAAAAAATATTTATTGGGAATAGGTOspArCCTTATTTTAAAGCGTTTTTAOspCfCACCATGAAAAAGAATACATTAAGTGCOspCrTTAAGGTTTTTTTTGGACTTTCTGC PrzykBad 2. Immunizacja zwierzt Przeprowadzono szereg badaD, ktre wykazaBy, |e rekombinowane biaBko TROSPA okre[lone sekwencj SEQ ID nr 3 i rekombinowane biaBko TROSPA-Salp15 okre[lone sekwencj SEQ ID nr 4 posiadaj wBa[ciwo[ci immunogenne i mog zosta wykorzystane jako skBadnik szczepionki. PrzeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca skierowane przeciwko rekombinowanemu biaBku TROSPA znacznie zmniejsz szanse zaka|enia nowych kleszczy poprzez zablokowanie lub utrudnienie oddziaBywania TROSPA - OspA. W ten sposb ograniczony zostanie naturalny rezerwuar bakterii, czego konsekwencj bdzie zmniejszona zapadalno[ na borelioz w[rd ludzi i zwierzt. Dodatkowo, przeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca, skierowane na antygen Salp15 obecny w rekombinowanym biaBku TROSPA-Salp15 bd chroniBy zwierz przed zaka|eniem na etapie wnikania krtkw poprzez niszczenie ochronnej otoczki utworzonej na powierzchni bakterii dziki oddziaBywaniu Salp15  OspC, podobnie jak opisano powy|ej (18). Szczepionka bazujca na rekombinowanych biaBkach TROSPA oraz TROSPA-Salp15 okre[lonych sekwencjami SEQ ID nr 3 i 4 mo|e by stosowana samodzielnie bdz w poBczeniu z rekombinowanymi biaBkami OspA i OspC krtkw Borrelia burgdorferi sensu lato. A) Immunizacja zwierzt poprzez do|ylne podanie preparatu zawierajcego oczyszczone rekombinowane biaBko TROSPA z Ixodes ricinus okre[lone sekwencj SEQ ID nr 3. Prowadzono ekspresj konstruktu genetycznego TROSPA okre[lonego sekwencj SEQ ID nr 1 w ukBadzie bakteryjnym z zastosowaniem systemu do ekspresji biaBka Champion"! pET200 Directional TOPO Expression Kit with BL21 Star"! (DE3) One Shotwg zaleceD producenta. Nastpnie oczyszczano rekombinowane biaBko TROSPA okre[lone sekwencj SEQ ID nr 3 przy u|yciu chromatografii powinowactwa za pomoc kolumny niklowej. Elucji rekombinowanego biaBka TROSPA dokonywano przy 200 mM st|eniu imidazolu. Obraz rozdziaBu elektroforetycznego oczyszczonego w ten sposb rekombinowanego biaBka TROSPA przedstawiono na figurze 2B. Preparat dializowano w buforze 1x PBS. Preparat o st|eniu 800 g/ml zostaB u|yty do immunizacji krlikw poprzez iniekcj do|yln. Zwierztom wstrzykiwano preparat w dawce 100 g, w czterech punktach czasowych: 0, 14, 28 i 56 dni. Surowice pobierano przed immunizacj, a nastpnie po 38, 66 i 87 dniach od pierwszej immunizacji. Obecno[ przeciwciaB w surowicy immunizowanych zwierzt stwierdzono metod Western-blot (Figura 7). W tym celu rozdzielano elektroforetycznie preparaty rekombinowanego biaBka TROSPA i przenoszono je na membran PVDF. Membran blokowano 1% roztworem BSA, a nastpnie inkubowano z surowic krlicz rozcieDczon 10 000 razy w buforze TBSTT. Detekcji zwizanych przeciwciaB anty-rekombinowane biaBko TROSPA dokonywano za pomoc komercyjnie dostpnych przeciwciaB anty-krliczych sprz|onych z alkaliczn fosfataz. B) immunizacja zwierzt poprzez doustne podanie preparatu zawierajcego oczyszczone rekombinowane biaBko TROSPA z Ixodes ricinus okre[lone sekwencj SEQ ID nr 3 lub oczyszczone rekombinowane biaBko TROSPA-Salp15 okre[lone sekwencj SEQ ID nr 4. Prowadzono ekspresje konstruktw genetycznych TROSPA okre[lonego sekwencj SEQ ID nr 1 i TROSPA-Salp15 okre[lonego sekwencj SEQ ID nr 2 w ukBadzie bakteryjnym z zastosowaniem systemu do ekspresji biaBka Champion"! pET200 Directional TOPO Expression Kit with BL21 Star"! (DE3) One Shotwg zaleceD producenta. Rekombinowane biaBko TROSPA okre[lone sekwencj SEQ ID nr 3 oczyszczano poprzez chromatografi powinowactwa na kolumnie niklowej. Elucji biaBka dokonywano przy 200 mM st|eniu imidazolu. Oczyszczony preparat rekombinowanego biaBka TROSPA-Salp15 okre[lonego sekwencj SEQ ID nr 4 uzyskano za pomoc chromatografii jonowymiennej z zastosowaniem zBo|a DEAE-celulozowego. Elucji biaBka dokonywano przy 200 mM st|eniu NaCl. Obraz rozdziaBu elektroforetycznego oczyszczonego rekombinowanego biaBka TROSPA przedstawiono na figurze 1B. Obraz rozdziaBu elektroforetycznego oczyszczonego rekombinowanego biaBka TROSPA-Salp15 przedstawiono na figurze 4. Preparaty biaBek dializowano w buforze 1x PBS. Preparat o st|eniu 1mg/ml zostaB u|yty do immunizacji oralnej szczurw. Zwierztom podawano sond do|oBdkow preparat zawierajcy 200 g jednego z biaBek lub preparat zawierajcy 200 g jednego z biaBek oraz adiuwant (GEM, 21). Preparaty podawano w trzech punktach czasowych: 0, 14, 28 dni. Surowice pobierano po 42 dniach od pierwszej immunizacji. Obecno[ przeciwciaB w surowicy immunizowanych zwierzt stwierdzono metod ELISA. MikropBytk ELISA opBaszczano rekombinowanym biaBkiem TROSPA lub rekombinowanym biaBkiem Salp15 poprzez inkubacj roztworu biaBka o st|eniu 5 g/ml w buforze PBSTT. Nastpnie pBytk pBukano piciokrotnie buforem PBSTT i blokowano poprzez inkubacj w 2% roztworze BSA w buforze PBSTT. Po zablokowaniu, pBytk pBukano piciokrotnie buforem PBSTT i inkubowano z seryjnymi rozcieDczeniami surowic immunizowanych szczurw lub surowic szczurw immunizowanych samym adiuwantem. Detekcji zwizanych przeciwciaB dokonywano przy u|yciu komercyjnie dostpnych przeciwciaB drugorzdowych anty-szczurzych sprz|onych z alkaliczn fosfataz, mierzc absorbancj produktu reakcji za pomoc fotometru Microplate Rider Model 550 firmy BIORAD. Poziom przeciwciaB oznaczano metod odwrotno[ci maksymalnego rozcieDczenia (Figura 8A i B, 22). C) immunizacja zwierzt poprzez doustne podanie preparatu oczyszczonych biaBek TROSPA z Ixodes ricinus okre[lonego sekwencj SEQ ID nr 3, OspA i OspC z Borrelia burgdorferi sensu lato. Prowadzono ekspresje konstruktw genetycznych TROSPA okre[lonego sekwencj SEQ ID nr 1, OspA i OspC w ukBadzie bakteryjnym z zastosowaniem systemu do ekspresji biaBka Champion"! pET200 Directional TOPO Expression Kit with BL21 Star"! (DE3) One Shotwg zaleceD producenta. Oczyszczano rekombinowane biaBka TROSPA okre[lone sekwencj SEQ ID nr 3, OspA i OspC przy u|yciu chromatografii powinowactwa na kolumnie niklowej. Elucji biaBek dokonywano przy 200mM st|eniu imidazolu. Preparaty biaBek dializowano w buforze 1x PBS. Preparat o st|eniu 1mg/ml zostaB u|yty do immunizacji oralnej szczurw. Zwierztom podawano sond do|oBdkow preparat zawierajcy po 200 g ka|dego z biaBek lub preparat zawierajcy po 200 g ka|dego z biaBek oraz adiuwant (GEM, 21). Preparaty podawano w trzech punktach czasowych: 0, 14, 28 dni. Surowice pobierano po 42 dniach od pierwszej immunizacji. Obecno[ przeciwciaB w surowicy immunizowanych zwierzt stwierdzono metod ELISA. MikropBytk ELISA opBaszczano rekombinowanym biaBkiem TROSPA, OspA lub OspC poprzez inkubacj roztworu biaBka o st|eniu 5 g/ml w buforze PBSTT. Nastpnie pBytk pBukano piciokrotnie buforem PBSTT i blokowano poprzez inkubacj w 2% roztworze BSA w buforze PBSTT. Po zablokowaniu, pBytk pBukano piciokrotnie buforem PBSTT i inkubowano z seryjnymi rozcieDczeniami surowic immunizowanych szczurw lub surowic szczurw immunizowanych samym adiuwantem. Detekcji zwizanych przeciwciaB dokonywano przy u|yciu komercyjnie dostpnych przeciwciaB drugorzdowych anty-szczurzych sprz|onych z alkaliczn fosfataz, mierzc absorbancj produktu reakcji za pomoc fotometru Microplate Rider Model 550 firmy BIORAD. Poziom przeciwciaB oznaczano metod odwrotno[ci maksymalnego rozcieDczenia (Figura 8C, 22). Opisane powy|ej testy dowiodBy, |e otrzymane rekombinowane biaBka TROSPA okre[lone sekwencj SEQ ID nr 3 oraz TROSPA-Salp15 okre[lone sekwencj SEQ ID nr 4 po wprowadzeniu do organizmu zwierzcego drog do|yln bdz pokarmow s zdolne do wywoBania odpowiedzi immunologicznej. BiaBka te zachowuj rwnie| natywn struktur, co udowadnia opisana powy|ej analiza zdolno[ci oddziaBywania rekombinowanego biaBka TROSPA okre[lonego sekwencj SEQ ID nr 3 z biaBkiem OspA. PrzeciwciaBa powstajce w organizmie zwierzcia po immunizacji rekombinowanym biaBkiem TROSPA okre[lonym sekwencj SEQ ID nr 3 zaburzaj oddziaBywanie midzy biaBkami TROSPA-OspA. Ponadto, przeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca, skierowane na antygen Salp15 obecny w rekombinowanym biaBku TROSPA-Salp15 okre[lonym sekwencj SEQ ID nr 4 bd chroniBy zwierz przed zaka|eniem na etapie wnikania krtkw poprzez niszczenie ochronnej otoczki utworzonej na powierzchni bakterii dziki oddziaBywaniu Salp15  OspC. Obserwacje te wskazuj, |e rekombinowane biaBka TROSPA okre[lone sekwencj SEQ ID nr 3 oraz rekombinowane biaBka TROSPA-Salp15 okre[lone sekwencj SEQ ID nr 4 mog sBu|y jako skBadniki szczepionki przeciwko boreliozie, chronice zwierzta przed zaka|eniem krtkiem Borrelia burgdorferi oraz minimalizujce prawdopodobieDstwo zaka|ania nowych kleszczy przez krtki Borrelia burgdorferi, a w konsekwencji zmniejszajcy pul krtkw kr|cych w [rodowisku. ZgBaszajcy: Instytut Chemii Bioorganicznej PAN PeBnomocnik: dr Aleksandra Twardowska rzecznik patentowy Lista sekwencji SEQ. nr 1: Sekwencja konstruktu genetycznego TROSPA ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGATAAGGATCATCCCTTCACCATGGCGGCTATGGAGGCTATGGCGGTGGATATGGAGGCTATGGCGGCGGCTATGGCGGCGGCTATGGTGGCTACGGACACGGTGGCTTCCTCGGCGGCTTCGGCTATGGCCACGGAGGCTACGGTGGCTATGGACACGGCGTCGCTGTCGCTGCCGCTCCAGTTGTCGCCAAGGTCGCTGCCCCAGTCGTCGCTGTCGGCCACGGCGGCCACGGTGGCTACGGACACGGTGGTTTCCTCGGCGGATACGGAGGTTACGGACACGGAGGATTCGGCGGCTACGGTCTCGGCCACGGCGTCGCTGTCCATGCTGCCCCAGTTGTCGCCAAGGTCGCTGCCCCAGTCGTCGCTGTCGGCCACGGCTACGGAGGCTTCGGTTACAGCGGATATGGCGGACACGGCTACGGACACTAAGCAATTCATCTCAAAGGGAAACCAACACTTCTTCGCCGCTTCTTATTTATGCGCTTGGGCCGACCAGAGCGCCGCTGGAAGTTGA SEQ. nr 2: Sekwencja konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15 ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGATAAGGATCATCCCTTCACCATGGCGGCTATGGAGGCTATGGCGGTGGATATGGAGGCTATGGCGGCGGCTATGGCGGCGGCTATGGTGGCTACGGACACGGTGGCTTCCTCGGCGGCTTCGGCTATGGCCACGGAGGCTACGGTGGCTATGGACACGGCGTCGCTGTCGCTGCCGCTCCAGTTGTCGCCAAGGTCGCTGCCCCAGTCGTCGCTGTCGGCCACGGCGGCTACGGTGGCTACGGACACGGTGGTTTCCTCGGCGGATACGGAGGTTACGGACACGGAGGATTCGGCGGCTACGGTCTCGGCCACGGCGTCGCTGTCCATGCTGCCCCAGTTGTCGCCAAGGTCGCTGCCCCAGTCGTCGCTGTCGGCCACGGCTACGGAGGCTTCGGTTACGGCGGATATGGCGGACACGGCTACGGACACTAAGCAATTCATCTCAAAGGGAAACCAACACTTCTTCGCCGCTTCTTATTTATGCGCTTGGGCCGACCAGAGCGCCGCTGGAAGTGAAGCGGCGGCGAAAGAAGCGGCGGCGAAAGAAGCGGCGGCGAAAGAAGCGGCGGCGAAAGAAGCGGCGGCGAAAGAAAACCTGTATTTTCAGGGAATGGAAAGCTTTGTTGCCATGAAAGTTGTTTGCATTACCGTGCTGTTTGTTATTGTTGCCGTTAATGAAAGCGCAACCAGCGAAGCACGTACCAGCAGCGCAGCAAAAGAAACCAAAAAAAAAAATGTGACCCTGCATTTTCCGAGCTATATCCGTAATCCGCAGAAACTGGCACTGGAACTGCTGGAAATTTGCAAAAATAATAAAAGCCGCAATAGCCTGCCGAGCACCAATTATAGCGCCATTAATGATAAATATGTGGATTTTAAAAATTGCACCTTTCTGTGCAAACATGCCGAAGATCGTAATGTTACCCTGGATCTGCCTCCGAATACCCTGTGTGGTCCGAATGGTGAAACCTGTGCAGAAAAAAGCAAATGCGTTGGTCATATTCCGGGTTGTTAA SEQ. nr 3: Sekwencja rekombinowanego biaBka TROSPA - produktu ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDHPFTMAAMEAMAVDMEAMAAAMAAAMVATDTVASSAASAMATEATVAMDTASLSLPLQLSPRSLPQSSLSATAATVATDTVVSSADTEVTDTEDSAATVSATASLSMLPQLSPRSLPQSSLSATATEASVTADMADTATDTKQFISKGNQHFFAASYLCAWADQSAAGS SEQ. nr 4: Sekwencja rekombinowanego biaBka TROSPA-Salp15 - produktu ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15 MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDHPFTMAAMEAMAVDMEAMAAAMAAAMVATDTVASSAASAMATEATVAMDTASLSLPLQLSPRSLPQSSLSATAATVATDTVVSSADTEVTDTEDSAATVSATASLSMLPQLSPRSLPQSSLSATATEASVTADMADTATDTKQFISKGNQHFFAASYLCAWADQSAAGSEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKENLYFQGMESFVAMKVVCITVLFVIVAVNESATSEARTSSAAKETKKKNVTLHFPSYIRNPQKLALELLEICKNNKSRNSLPSTNYSAINDKYVDFKNCTFLCKHAEDRNVTLDLPPNTLCGPNGETCAEKSKCVGHIPGC SEQ. nr 5: Oligonukleotyd DNA TROSPAF TTTGGTCTCAAGGTATGGCGGCTATGGAGGC SEQ. nr 6: Oligonukleotyd DNA TROSPAR ATATTTAAATTCAACTTCCAGCGGCGC SEQ. nr 7: Oligonukleotyd DNA TROTOPF CACCATGGCGGCTATGGAGGC SEQ. nr 8: Oligonukleotyd DNA TRORPST ATCTGCAGTCAACTTCCAGCGGCGCTCTGGTCGG SEQ. nr 9: Oligonukleotyd DNA FUS11Af CACCATGGCGGCTATGGAGGCTATGGCGG SEQ. nr 10: Oligonukleotyd DNA FUS11Ar ATGGATCCTTAACAACCCGGAATATGACCA Zastrze|enia patentowe Szczepionka przeciw boreliozie bazujca na kleszczowych biaBkach TROSPA oraz TROSPA-Salp15, znamienna tym, |e zawiera rekombinowane biaBko TROSPA okre[lone sekwencj SEQ. nr 3 lub rekombinowane biaBko TROSPA-Salp15 okre[lone sekwencj SEQ. ID nr 4. Szczepionka wedBug zastrz. 1, znamienna tym, |e zawiera biaBko bdce produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA okre[lonego sekwencj SEQ. nr 1 lub rekombinowane biaBko bdce produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15 okre[lonego sekwencj SEQ. nr 2. Szczepionka wedBug zastrz. 1, znamienna tym, |e rekombinowane biaBko TROSPA i/lub TROSPA-Salp15 posiada wBa[ciwo[ci immunogenne. Szczepionka wedBug zastrz. 1, znamienna tym, |e jest stosowana samodzielnie lub w poBczeniu z biaBkami OspA i OspC krtkw Borrelia burgdorferi sensu lato. Szczepionka wedBug zastrz. 1 albo 4, znamienna tym, |e szczepionka zawiera preparat biaBek rekombinowanych TROSPA z Ixodes ricinus oraz OspA i OspC z Borrelia burgdorferi sensu lato. Szczepionka wedBug zastrz. 1, znamienna tym, |e chroni zwierz przed zaka|eniem na etapie wnikania krtkw. Szczepionka wedBug zastrz. 1, znamienna tym, |e przeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca oddziaBuj z biaBkiem TROSPA w jelicie Ixodes ricinus. Szczepionka wedBug zastrz. 1, znamienna tym, |e przeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca skierowane na biaBka Salp15 oddziaBuj z ochronn otoczk utworzonej na powierzchni bakterii przez oddziaBywanie Salp15  OspC. Szczepionka wedBug zastrz. 1, znamienna tym, |e przeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca skierowane na biaBka TROSPA blokuj lub utrudniaj oddziaBywania TROSPA  OspA, za[ przeciwciaBa skierowane na antygen Salp15 obecny w biaBku fuzyjnym TROSPA-Salp15 chroni zwierz przed zaka|eniem na etapie wnikania krtkw niszczc ochronn otoczk utworzon na powierzchni bakterii poprzez oddziaBywanie Salp15  OspC. Szczepionka wedBug zastrz. 1, znamienna tym, |e przeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca skierowane na biaBka TROSPA zmniejszaj szanse zaka|enia nowych kleszczy Ixodes ricinus. Konstrukt genetyczny TROSPA, znamienny tym, |e stanowi sekwencj SEQ. ID nr 1. Konstrukt genetyczny TROSPA-Salp15, znamienny tym, |e stanowi sekwencj SEQ. ID nr 2. Rekombinowane biaBko TROSPA bdce produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA, znamienne tym, |e posiada sekwencj SEQ. ID nr 3. Rekombinowane biaBko TROSPA-Salp15 bdce produktem ekspresji konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15, znamienne tym, |e posiada sekwencj SEQ. nr 4. Rekombinowane biaBko wedBug zastrz. 13 albo 14, znamienne tym, |e posiada wBa[ciwo[ci immunogenne. Rekombinowane biaBko wedBug zastrz. 13 albo 14, znamienne tym, |e oddziaBuje z biaBkiem OspA z Borrelia burgdorferi sensu lato. Sposb otrzymywania konstruktu genetycznego TROSPA okre[lonego zastrze|eniem 11, znamienny tym, |e amplifikuje si gen kodujcy biaBko TROSPA I. ricinus metod PCR na podstawie DNA wyizolowanego z I. ricinus ze starterami o sekwencji SEQ. ID nr 5 i SEQ. ID nr 6, a nastpnie poddaje si go skBadaniu (splicingowi) w komrkach ro[linnych, po czym amplifikuje si uzyskany mRNA TROSPA metod odwrotnej transkrypcji i PCR za pomoc starterw o sekwencji SEQ. ID nr 7 i SEQ. ID nr 8, a nastpnie klonuje si w wektorze pET200/D-TOPO. Sposb otrzymywania konstruktu genetycznego TROSPA-Salp15 okre[lonego zastrze|eniem 12, znamienny tym, |e syntezuje si DNA na podstawie konstruktu genetycznego okre[lonego SEQ. ID nr 1 oraz sekwencji kodujcej biaBko Salp15 Iric-1 (gb EU128526.1), zoptymalizowanej w kierunku ekspresji w ukBadzie bakteryjnym, a nastpnie uzyskan sekwencj DNA TROSPA-Salp15 okre[lon SEQ. ID nr 2 amplifikuje metod PCR ze starterami FUS11Af okre[lonym SEQ. ID nr 9 i FUS11Ar okre[lonym SEQ. ID nr 10, a nastpnie klonuje si w wektorze pET200/D-TOPO. Sposb otrzymywania szczepionki okre[lonej zastrze|eniami 1 do 10, znamienny tym, |e prowadzi si ekspresj konstruktu genetycznego okre[lonego SEQ. ID nr 1 lub SEQ. ID nr 2 w E. coli. Sposb otrzymywania rekombinowanych biaBek okre[lonych zastrze|eniami 13 oraz 14, znamienny tym, |e prowadzi si ekspresj konstruktu genetycznego SEQ. ID nr 1 lub SEQ. ID nr 2 w E. coli. Zastosowanie rekombinowanych biaBek TROSPA okre[lonego w zastrze|eniu 13 oraz TROSPA-Salp15 okre[lonego w zastrze|eniu 14 pochodzcych z kleszcza pospolitego (I. ricinus) do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie do immunizacji zwierzt. Zastosowanie wedBug zastrz. 21, w ktrym preparat zawierajcy oczyszczone rekombinowane biaBko TROSPA o sekwencji SEQ. nr 3 podawany jest do|ylnie. Zastosowanie wedBug zastrz. 21, w ktrym preparat zawierajcy oczyszczone rekombinowane biaBko o sekwencj SEQ. nr 3 lub SEQ. nr 4 podawany jest doustnie. Zastosowanie wedBug zastrz. 21, w ktrym preparat zawierajcy oczyszczone rekombinowane biaBka o sekwencji SEQ. nr 3 oraz rekombinowane biaBka OspA i OspC z Borrelia burgdorferi sensu lato podawany jest doustnie. ZgBaszajcy: Instytut Chemii Bioorganicznej PAN PeBnomocnik: dr Aleksandra Twardowska rzecznik patentowy Literatura Chmielewska-Badera J. 1998. Seroepidemioligic study of Lyme boreliosis in the Lublin Region. Ann. Agric. Environ. Med. 5: 183-186. Cisak E., Chmielewska-Badora J., ZwoliDski J., Wjcik-Fatla A., Polak J., Dutkiewicz J. 2005. Risk of tick-borne bacterial dieseases among workers of Roztocze National Park (South-Eastern Poland). Ann. Agric. Environ. Med. 12: 127-132. Derdkov M., Len kov. 2005. Association of genetic variability within the Borrelia burgdorferi sensu lato with the ecology, epidemiology of Lyme borreliosis in Europe. Ann. Agric. Environ. Med. 12: 165  172 Zpiewak R. 2004. Zawodowe choroby skry u rolnikw indywidualnych. Post Dermatol. Alergol. 21: 278-285. Wodecka B., Skotarczak B. 2000. Genetyczna zmienno[ Borrelia burgdorferi s. l. U kleszczy Ixodes ricinus zebranych w pBnocnozachodniej Polsce. Wiadomo[ci parazytologiczne. 46: 475-485. Vazquez M., Muehlenbein C., Cartter M., Hayes E. B., Ertel S., Shapiro E. D. 2008. Effectiveness of personal protective measures to prevent Lyme disease. Emerg. Infect. Dis. 14: 210 216. Connally N. P., Durante A. J., Yousey-Hindes K. M., Meek J. I., Nelson R. S., Heimer R. 2009. Peridomestic Lyme disease prevention: results of a population-based case-control study. Am. J. Prev. Med. 37: 201 216. Corapi K. M., White M. I., Phillips C. B., Daltroy L. H., Shadick N. A., Liang M.H. 2007. Strategies for primary and secondary prevention of Lyme disease. Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 3: 20 25. Steere A. C. 2008. Lyme disease vaccines. In Plotkin S. A., Orenstein W. A., Offit P. A. eds. Vaccines. Philadelphia: Saunders-Elsevier, 1253 66. Sigal L. H., Zahradnik J. M., Lavin P., et al. 1998. A vaccine consisting of recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface protein A to prevent Lyme disease. Recombinant Outer-Surface Protein A Lyme Disease Vaccine Study Consortium. N. Engl. J. Med. 339: 216 22. Abbott A. 2006. Lyme disease: uphill struggle. Nature 439, 524 525. Croke C. L., Munson E. L., Lovrich S.D., et al. 2000. Occurrence of severe destructive Lyme arthritis in hamsters vaccinated with outer surface protein A and challenged with Borrelia burgdorferi. Infect. Immun.68: 658 63. Nardelli D. T., Munson E. L., Callister S. M., Schell R. F. 2009. Human Lyme disease vaccines: past and future concerns. Future Microbiol. 4: 457 69. Drouin E. E, Glickstein L., Kwok W. W., Nepom G. T., Steere A. C. 2008. Human homologues of a Borrelia T cell epitope associated with antibioticrefractory Lyme arthritis. Mol. Immunol. 45: 180 9. Earnhart, C. G., Buckles, E. L., and Marconi, R. T. 2007. Development of an OspC-based tetravalent, recombinant, chimeric vaccinogen that elicits bactericidal antibody against diverse Lyme disease spirochete strains. Vaccine 25: 466 480. Bhattacharyaa D., Bensacib M., Lukerc K. E., et. al. 2011. Development of a baited oral vaccine for use in reservoir-targeted strategies against Lyme disease. Vaccine, 29: 7818 7825. Dai J., Wang P., Adusumilli S., et. al., 2009. Antibodies against a Tick Protein, Salp15, Protect Mice from the Lyme Disease Agent. Cell Host & Microbe, 6: 482 492. Pal U., Li X., Wang T., Montgomery R. R. et al. 2004. TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi. Cell, 119: 457-468. Hovius J. W., Ramamoorthi N., Van't Veer C. et al. 2007. Identification of Salp15 homologues in Ixodes ricinus ticks. Vector Borne Zoonotic Dis. 7: 296-303. Dai J., Wang P., Adusumilli S., et. al., 2009. Antibodies against a Tick Protein, Salp15, Protect Mice from the Lyme Disease Agent. Cell Host & Microbe, 6: 482 492. Saluja V., Visser M. R., van Roosmalen M. L. et al. 2010. Gastro-intestinal delivery of influenza subunit vaccine formulation adjuvanted with Gram-positive enhancer matrix (GEM) particles. Eur. J. Pharm. Biopharm. 76: 470-474. Frey A., Di Canzio J. i Zurakowski D. 1998. A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays. J. Immunol. Meth. 221:35 41 Skrt opisu Przedmiotem wynalazku jest szczepionka przeciw boreliozie, konstrukt genetyczny, rekombinowane biaBko, sposb otrzymywania konstruktu genetycznego, sposb otrzymywania szczepionki, sposb otrzymywania rekombinowanych biaBek, zastosowanie rekombinowanych biaBek do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie. Bardziej szczegBowo rozwizanie dotyczy zastosowania rekombinowanych biaBek TROSPA oraz TROSPA-Salp15 pochodzcych z kleszcza pospolitego (I. ricinus) jako skBadnika szczepionki dla zwierzt przeciwko boreliozie. PrzeciwciaBa obecne we krwi immunizowanego krgowca skierowane na biaBka TROSPA znacznie zmniejsz szanse zaka|enia nowych kleszczy poprzez zablokowanie lub utrudnienie oddziaBywania biaBka kleszczowego TROSPA z biaBkiem OspA krtka Borrelia burgdorferi sensu lato. OddziaBywanie to jest kluczowe dla procesu zasiedlenia kleszcza przez krtki. PrzeciwciaBa skierowane na biaBko TROSPA-Salp15 bd chroniBy krgowca przed zaka|eniem na etapie wnikania krtkw Borrelia poprzez niszczenie ochronnej otoczki utworzonej na ich powierzchni dziki oddziaBywaniu kleszczowego biaBka Salp15 i krtkowego biaBka OspC. Szczepionka bazujca na kleszczowych biaBkach TROSPA oraz TROSPA-Salp15 mo|e by stosowana samodzielnie bdz w poBczeniu z rekombinowanymi biaBkami OspA i OspC krtkw Borrelia burgdorferi sensu lato. 8 figur 24 zastrze|enia patentowe ZgBaszajcy: Instytut Chemii Bioorganicznej PAN PeBnomocnik: dr Aleksandra Twardowska rzecznik patentowy     PAGE  PAGE 27 22357/PAT/12 77779 999999999l::;r; <<<L<N<b<h<j<<<<<<<=:=L=R=T=h=Ż}y}y}uny}jcj}}\ h\1!h\ hS{hS{hS{ hS{hX~hX~hRh\ h` heh=% h,6he he6heheOJQJ^JhglOJQJ^JhpVOJQJ^Jh{OJQJ^Jh tOJQJ^JhFOJQJ^Jh B0JOJQJ^JhF0JOJQJ^JhFhF0JOJQJ^J$h=n=======P>R>f>>>>,?^?x???@@~@@@@A>A~AABBCCDDDD6EHEREXEEEEE8FJFvFFFFG񽷱hdhi-h^hR hR0J h^0J h B0J h0J hU0J h80J hX~0JhX~hS hUhehU h1hlKhlK h,h, h1heh,h}ihe h` heh\2GGbGjGlGGGGGGGGGGHH,H.HFHHH*I>IKK0K4KHKKKKK,LDLFLNLnLpLLLLM M6M8MFMJM:NNN@OBO\Oؼؼؼؼؼؼ؞؞؞ؚ hShShSh/]h/]6h/]hhX aJhh0JaJhh6aJhhaJ h86hhp6aJh]ThhpaJ hWoaJhhE}Gh 0hehVQhe64\OOP2PRP\P`PbPxPPPPPQ QQQR8RLRNRRRTRfRRRRRRRRRRRRRSû÷÷îvlv_hthbOJQJ^JhbOJQJ^JhthtOJQJ^JhtOJQJ^JhE}GOJQJ^Jh heOJQJ^JheOJQJ^JhhpaJhE}Gh,hh,h6h,h h B0J h80JhFh80J h80J h80J6hglh80J6hW,h80Jh8$S S&S.S0SBSXSpSSSSSSTTUUxUUUUUU0V2VdVtVvVVVVW W(W,WRWVW.X>XX(YHYYYZZϸϫuhNhe6OJQJ^Jh*OJQJ^JhOJQJ^Jh;y}OJQJ^JheOJQJ^Jh heOJQJ^JhtheOJQJ^JhuYOJQJ^JhthE}GOJQJ^JhthbOJQJ^JhtOJQJ^Jh htOJQJ^J-ZZr[t[[[[[ \ \\ \"\\\\\\]]]`]d]f]F^H^~^^^^^^^^^ _6_V_b_l___`"`$`&`*`4`L`P`h`j`r``````հ馜hmUKOJQJ^Jh/OJQJ^JhE}GOJQJ^JhDbhe6OJQJ^Jht+,heOJQJ^JheOJQJ^Jh BOJQJ^Jh heOJQJ^Jh9[OJQJ^J9`aaa$a&a2a4aFaJafalatavaxaaaaaaaXbnbbbbcPcRcbc~ccccccd*d,d2d4dh6aJ hbaJhr>haJ hr>h hSIhNqhNqh@ hE}G h h@ hb hthYV hJ/hYV hJ/h@ hYV1pp\q||~@BtvĪƪȪ,.J$[$\$a$gdI$dh[$\$a$gd B Sdh`SgdIK$dh[$\$`a$gde$dh[$\$a$gdIqq.qXq\q^qqqqrrr2s`srssstttthttttƼƲufVIVh1y0J6OJQJ^Jh [she0J6OJQJ^JhHhe0JOJQJ^JhW,he0JOJQJ^JhHOJQJ^JheOJQJ^JhUheOJQJ^Jh1yh1yOJQJ^Jh1yOJQJ^JheOJQJ^JhbiOJQJ^Jh'heOJQJ^Jh'h'OJQJ^Jh'OJQJ^Jh'6OJQJ^Jttttuuuvvvvvvwwfyvyyzl{{{{|||^}z}}}}ǻǯǯǣǔǣLjLjLj|rhrZPh1yOJQJ^Jhhe6OJQJ^Jhz|OJQJ^JheOJQJ^JhI0JOJQJ^Jh u0JOJQJ^Jh|Rhe0JOJQJ^Jh'_0JOJQJ^Jh[j+0JOJQJ^Jhz|0JOJQJ^Jhe0JOJQJ^JhHh'_0JOJQJ^JhHhe0JOJQJ^JhHhe0JOJQJ^J}}}~B~\~~~~~~~6JLl8܀ @j~>@Pߴߪ骛rfZhe0JOJQJ^Jhe0JOJQJ^Jh0J6OJQJ^Jhyhe0J6OJQJ^Jh0JOJQJ^JhW,he0JOJQJ^JhyOJQJ^JhUheOJQJ^JhMOJQJ^JhO*OJQJ^Jhz|OJQJ^JheOJQJ^Jh1yOJQJ^Jh1yh1yOJQJ^J"PRʂ 46,."~҉,JTNƹ|r|hrh|^|h|h|h BOJQJ^JheOJQJ^JhX_OJQJ^Jh heOJQJ^Jh'_0JOJQJ^Jh B0JOJQJ^JhW0JOJQJ^Jh0JOJQJ^Jh1yh1yOJQJ^Jh1yOJQJ^Jh1y0JOJQJ^Jh=O0JOJQJ^Jhe0JOJQJ^JhB0JOJQJ^J$:JL֌6r(@BFH<PRrܑǺuuh}#TOJQJ^Jh$6OJQJ^Jh1yhOJQJ^JhOJQJ^Jh6OJQJ^Jhhe6OJQJ^Jh heOJQJ^Jhe0JOJQJ^JhI0JOJQJ^Jh'_OJQJ^Jh heOJQJ^JheOJQJ^J.J^`zԓ֓"L`b|~ΔҔԔ*,ܖޖDF6ջ߻wwk_k_kh'_0JOJQJ^Jhe0JOJQJ^Jhe0JOJQJ^Jh0J6OJQJ^Jh}#The0J6OJQJ^Jh0JOJQJ^JhW,he0JOJQJ^JhW,heOJQJ^JhUheOJQJ^JheOJQJ^Jh}#TOJQJ^Jh1yh4|$OJQJ^Jh4|$OJQJ^J 6rΙ*,TVšĚƚؚښBDvěPRXZޜrT`bdtv0DFl8~ÿh1yhaJhhZh)h1yhDYqaJhDYqhWhIKhIh8OJQJ^Jh BOJQJ^JheOJQJ^JhOJQJ^Jh heOJQJ^J=ԣxҥԥ֥ ^hȧܧ.XlnptxFnpz 4ªĪƪ*,īƼƼh8JOJQJ^JhJEiOJQJ^JhaFhJEi5 hC5 hI5hIOJQJ^Jh BOJQJ^JhIKh)hZhZ6hZhpH6 h hpHh1yhpHaJhZhpH8«īL  $&$[$\$a$gdJEi$dh[$\$a$gdJEi"$ 2( Px 4 #\'*.25@9a$gdJEi$dh[$\$a$gdv6dhgdJEi "6<L$:JL`f$&.0>RTlp|~мԼvLTVnɲɨ쨛ɲ쨛}hoOJQJ^Jh+OJQJ^JhOJQJ^JhhOJQJ^Jh sOJQJ^JhOJQJ^JhJEihJEiOJQJ^Jh8JOJQJ^J hJEiaJhJEihJEiaJhJEiOJQJ^Jh2OJQJ^Jh8OJQJ^J1&(>vVXn2jl2$dh[$\$a$gdo$dh[$\$a$gd$[$\$a$gdJEin"02h"02vx:PRܸܸܸ{uo hi2aJ hIaJ h BaJ hJEiaJhOJQJ^JhQ/hT0OJQJ^JhWhT0OJQJ^JhT0hT0OJQJ^JhT0OJQJ^JhohoOJQJ^JhihoOJQJ^JhoOJQJ^JhWhoOJQJ^JhT0hoOJQJ^J+2xzR"$ 2( Px 4 #\'*.25@9a$gdJEi$[$\$a$gdJEi$dh[$\$a$gdT0$dh[$\$a$gd$dh[$\$a$gdo"$ 2( Px 4 #\'*.25@9a$gdJEi"$ 2( Px 4 #\'*.25@9a$gdJEi246*Bb ,2RTVZ\bTV\TͶxjhlh|6OJQJ^Jh|OJQJ^Jhlh|OJQJ^Jh`4hlOJQJ^Jhv6hlOJQJ^JhhlOJQJ^JhlOJQJ^Jhp hlOJQJ^JhlhlOJQJ^Jhv6OJQJ^JhJEiheaJhv6hv65 hi25 hIaJ)46*T\2L 2$ & Fdh[$\$a$gd8J$ & Fdh[$\$a$gd|$ & Fdh[$\$a$gdl$dh[$\$a$gdv6"$ 2( Px 4 #\'*.25@9a$gdJEi>Nn~>@vD\| 2BDRVF :@HVnz~h8h|6OJQJ^Jhp h|OJQJ^Jh h|OJQJ^Jh hlOJQJ^Jhl6OJQJ^Jh8hl6OJQJ^Jh8hlOJQJ^JhlOJQJ^Jh|OJQJ^J9hjHL:@FJLNrv<LP魠閭鷭鷠|rhUuOJQJ^Jh8Jh{,OJQJ^Jh8JhlOJQJ^Jh%\OJQJ^Jh8Jh%\OJQJ^Jh8JOJQJ^Jh8Jh8JOJQJ^Jh8hl6OJQJ^Jhp hlOJQJ^Jh|OJQJ^JhlOJQJ^Jh hlOJQJ^J,  $p2zBV~bxȾȴxnxnxahl-%h~OJQJ^Jh*XOJQJ^JhN3OJQJ^Jhl-%h55OJQJ^Jhh6OJQJ^JhOJQJ^Jhp hOJQJ^Jh%\OJQJ^Jh|OJQJ^Jhp h ZOJQJ^JhUuOJQJ^Jh8Jh8JOJQJ^Jh8JOJQJ^JhlOJQJ^J 2"`R<fLNk$dh[$\$`a$gd/$ & Fdh[$\$a$gd$ & Fdh[$\$a$gdjO$ & Fdh[$\$a$gdp, $ & Fdh[$\$a$gd55$ & Fdh[$\$a$gd$ & Fdh[$\$a$gd%\ ,B^08: "h $˽岽ببببببببب؀h0 oOJQJ^Jh*XOJQJ^Jhl-%OJQJ^JhB4OJQJ^JhN3OJQJ^Jh 6OJQJ^Jhl-%h~6OJQJ^Jhl-%h~OJQJ^Jhl-%h55OJQJ^Jhl-%hl-%6OJQJ^Jhl-%hl-%OJQJ^J2\` h*`rtvx&.>LR FȺܰҦҦҰҰҰwwjh8hv6OJQJ^Jh|OJQJ^Jh9sOJQJ^Jhhv6OJQJ^Jhci3hjO6OJQJ^JhlOJQJ^JhjOOJQJ^Jhci3hci36OJQJ^Jhci3OJQJ^JhN3OJQJ^Jhp, OJQJ^Jhl-%h55OJQJ^Jhl-%h0 oOJQJ^J(:<tvx 24N\^ "$&jlù͎ͯͯ̈́z͎mͯh8h;OJQJ^JhvyOJQJ^Jh;OJQJ^Jh|OJQJ^Jh#EOJQJ^Jh8hp, OJQJ^Jhp, OJQJ^Jh55OJQJ^Jh!8OJQJ^Jh8h8OJQJ^JhN3OJQJ^Jh8hv6OJQJ^Jh8hv66OJQJ^J(02NXZ\rHNP:BXFHȾȴȾȪȜyuk^RHh*'hNCJ\h*'hN6CJ]h*'hNCJmH sH h*'hN5aJhNh*'OJQJ^Jh9fh8OJQJ^Jhde6OJQJ^Jh8h86OJQJ^Jh|OJQJ^JhC]OJQJ^Jh5OJQJ^Jh8h8OJQJ^Jh8hp, OJQJ^Jhp, OJQJ^Jh55OJQJ^JhRtOJQJ^JNP :<>@BX^6"$ & FP7$8$H$^`a$gdi2 & FP7$8$H$^`gdi2 dh7$8$H$gdN$[$\$a$gd*'$dh[$\$a$gd*' $h^ha$gdNH b@b "Vdz$BtVZ (@2TVlꨞꨞh*'hNCJmHsHh*'hN6CJh*'hN6CJmH sH h*'hNCJ\h*'hN6CJ]h*'hNCJ\mH sH h*'hN6CJ]mH sH h*'hNCJmH sH h*'hNCJ8B@l@"    gd  & FP[$\$^`gdi2$ & FP[$\$^`a$gdi2 & FP7$8$H$^`gdi2 & FP7$8$H$^`gdi2 &:F@NPHpv~24@ƽƽucSuh*'heCJ\aJmH sH "h*'he5CJ\aJmH sH h*'heCJaJmH sH h*'heCJh*'he0J6CJh*'heCJ\mH sH h*'heCJmH sH h*'hNqCJh*'hNCJh*'hN6CJh*'hNCJmH sH !h*'hNB* CJmH phfsH !h*'hNB*CJmH phsH ("    2 > X Z j l x |        D  ƳƤ٤٘xe$h*'heCJaJmH nH sH tH h*'heCJaJnH tH  h*'he0JCJaJmH sH h*'he6CJaJh*'heCJaJmH sH %h*'heB* CJaJmH phfsH %h*'heB*CJaJmH phsH h*'heCJaJh*'he0JCJaJh*'he0J6CJaJ'       " * D F p z | ~  ^ ".nRx|rŻwphphpphpw_h97qhi2aJhr>hi26 hr>hi2hr>hi26aJhr>hi2aJ hN3hi2hN3hi2aJhi2hi25aJ hi2aJ hT )aJhPAh]/&mH sH h]/&OJQJ^Jh]/&mH sH h*'heCJaJ$h*'heCJaJmH nH sH tH 'h*'he6CJaJmH nH sH tH "   " $ & ( * D F  $[$\$a$gdi2$dh[$\$a$gdi2dhgdi2 dh7$8$H$gdegd]/&$dh[$\$`a$gd]/&  ".0268DFJLNRlnpr͸h,hi2hi25CJh Y0J"mHnHuhj hj0J"jhj0J"Uh?jh?Uh hi2aJhi2OJQJ^J 246NPRlnpr dh7$8$H$gde! !&`#$gdM= 0P&P 1h:p`H. A!"#$% $$If!vh55K#v#vK:V l t065-5pytW$$If!vh55K#v#vK:V l t065-5pytW$$If!vh55K#v#vK:V l t065-5pytW$$If!vh55K#v#vK:V l t065-5pytW$$If!vh55K#v#vK:V l t065-5pytW$$If!vh55K#v#vK:V l t065-5pytW$$If!vh55K#v#vK:V l t065-5pytW$$If!vh55K#v#vK:V l t065-5pytW$$If!vh55K#v#vK:V l t065-5pytW$$If!vh55K#v#vK:V l t065-5pytW$$If!vh55K#v#vK:V l t065-5pytWf% 666666666vvvvvvvvv666666>6666666666666666666666666666666666666666666666666hH6666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666662 0@P`p2( 0@P`p 0@P`p 0@P`p 0@P`p 0@P`p 0@P`p8XV~OJQJ_HmHnHsHtHN`N (6Normalny$a$CJOJQJ_HmHsHtHf f !" NagBwek 1$dd@&[$\$a$5CJ0KH$\aJ0mHsHtHJA`J Domy[lna czcionka akapituPi@P 0 Standardowy4 l4a ,k , 0 Bez listy ROR Qheader2$dd[$\$a$OJPJQJ^JaJP/P !"NagBwek 1 Znak5CJ0KH$OJQJ\aJ04W 4 LE` Pogrubienie5\t#t # Tabela - Siatka7:V0e 2 $0HTML - wstpnie sformatowany=$ 2( Px 4 #\'*.25@9a$CJOJQJmHsHtHf/Af $0!HTML - wstpnie sformatowany Znak OJQJ^JZ/RZ @Default 7$8$H$%B*CJ^J_HaJmHphsHtH<Ob< edesc$dd[$\$a$aJ oq ejrnlo est6X`6 e@ Uwydatnienie6]*o* e highlightNON hE printabstract$dd[$\$a$aJN' N `kOdwoBanie do komentarzaCJaJ@@ `kTekst komentarzaCJBjB `kTemat komentarza5\FF `k Tekst dymkaCJOJQJ^JaJ@@ itemid $dd[$\$a$aJ8@8  BNagBwek ! p#0)@!0  B Numer strony2(12 `H Numer wiersza4 B4 i2Stopka $ p#PK![Content_Types].xmlj0Eжr(΢Iw},-j4 wP-t#bΙ{UTU^hd}㨫)*1P' ^W0)T9<l#$yi};~@(Hu* Dנz/0ǰ $ X3aZ,D0j~3߶b~i>3\`?/[G\!-Rk.sԻ..a濭?PK!֧6 _rels/.relsj0 }Q%v/C/}(h"O = C?hv=Ʌ%[xp{۵_Pѣ<1H0ORBdJE4b$q_6LR7`0̞O,En7Lib/SeеPK!kytheme/theme/themeManager.xml M @}w7c(EbˮCAǠҟ7՛K Y, e.|,H,lxɴIsQ}#Ր ֵ+!,^$j=GW)E+& 8PK!RY7mtheme/theme/theme1.xmlYMoE#F{oc'vGuرHF[x=ޝzvg53NjHH8PTj%.H 3kT\}yg CDHfP\ IC>i n$N4)߻UL>JeKK2e,/nEހbFZ͹ #ζKk_9 adZĈꔔK=.xMfdC6Nb-켱K\X" T30P's~Stу>G%M.O"Mry8E?ԥL#SCߜbGӣE|Eʀ'<{(Z"y'N<.Ev,I A6Nv&t"-=1c8U8")QHcBJK] .H0-uIlm2-fjqVf9P('suXmd)̪eY(G]Y䀰zoP nI xy "=kk|l1Q~6M%7_ǬZQ yٿ jmZx^(Q\gQ>BANT~jCoEA3d]dm2iVֵ褽Vl<s,>gÙ/ΫŋtvavDWCd(, ~{-0%M2&a: _PK! ѐ'theme/theme/_rels/themeManager.xml.relsM 0wooӺ&݈Э5 6?$Q ,.aic21h:qm@RN;d`o7gK(M&$R(.1r'JЊT8V"AȻHu}|$b{P8g/]QAsم(#L[PK-![Content_Types].xmlPK-!֧6 +_rels/.relsPK-!kytheme/theme/themeManager.xmlPK-!RY7mtheme/theme/theme1.xmlPK-! ѐ' theme/theme/_rels/themeManager.xml.relsPK]  %%%336( F(-f08C HMSTX_cgpjs6nƾ\ 7h=G\OSZ`,eNgqt}P6nH rvxyz{|}~  !"#$%&'(*,02346789;=>?ALAȈjPccc*ddd eneee0fp&22N rw )+-./15:<@B !6!!8@0(  B S  ?8Tj9Tj$:Tj;TjGTj?Tj@Tj,ATjBTj4CTj HDTjDETj6FTj*GTjHTjITj$JTjKTjLTjMTjNTj$OTjPTj\QTjăRTjoSTjUj?Uj$@UjdAUjBUjCUjDUj4EUjtFUjGUjHUj4IUjtJUj_KUj\_LUj_MUj_NUj`OUj\`PUj`QUj`RUjԽSUjTUjTUUjVUjԾWUjXUjYUj̖ZUj [UjL\Uj]Uj̗^Uj _UjL`UjaUj4bUjtcUjdUjeUjtfUjgUjhUjdiUjjUjkUj$lUjdmUjnUjoUj$pUjqUjrUjsUj\tUjuUjvUjwUj\xUjyUjDLzUjL{UjL|UjM}UjDM~UjMUjMUjNUjDNUjNUjNUjOUjIUj\IUjIUjIUjJUj\JUjJUjJUjKUj\KUjKUjtEUjEUjEUj4FUjtFUjFUjFUj4GUjtGUjGUjGUj4HUj BUjLBUjBUjBUj CUjLCUjCUjCUj DUjLDUjDUjDUjUjUjUj\UjUjUjUj\UjUjUjUj\Uj4UjtUjUjUj4UjtUjUjUjtUjUjUj UjLUjUj̽Uj UjLUjUj UjLUjUjUj\UjUjܹUjUj\UjUjܺUjUj\UjUjܻUjUjUj4UjtUjUjUj4UjtUjUjUj4UjtUjL:Uj:Uj:Uj ;UjL;Uj;Uj;Uj <UjL<Uj<Uj<Uj =Uj6Uj$7Ujd7Uj7Uj7Uj$8Ujd8Uj8Uj8Uj$9Ujd9Uj9Uj|3Uj3Uj3Uj<4Uj|4Uj4Uj4Vj<5Vj|5Vj5Vj5Vj<6Vj0VjT0Vj0Vj0 Vj1 VjT1 Vj1 Vj1 Vj2VjT2Vj2Vj2Vj<Vj|VjVjVj<Vj|VjVjVj<Vj|VjVjVj VjVjT Vj!Vj"Vj#VjT$Vj%Vj&Vj'VjT(Vj)Vj|*Vj+Vj,Vj<-Vj|.Vj/Vj0Vj<1Vj|2Vj3Vj4Vj<5Vj|6Vj7Vj8Vj\9Vj:Vjܐ;VjVjܑ?Vj@Vj\AVjBVjܒCVjDVj\EVjFVj<GVj|HVjIVjJVj<KVj|LVjMVjNVj<OVj|PVjQVjTRVjSVjԥTVjUVjTVVjWVjԦXVjYVjTZVj[Vjԧ\Vj]VjT^Vj_VjԨ`VjaVjTbVjBcVjBdVj$CeVjdCfVjCgVjChVj$DiVjdDjVjDkVjDlVj$EmVjdEnVjEoVjEpVj$FqVjdFrVjFsVjFtVj$GuVjlvVjwVjxVj,yVjlzVj{Vj|Vj,}Vjl~VjVjVj,VjlVjVjVj,VjlVjVjVjTVjVjVjVjTVjVjVjVjTVjVjVjVjTVjVjVjVjTVjVjVj4VjtVjVjVj4VjtVjVjVj4VjtVjVjVj4VjtVjVj4VjtVjVjVjVjVj,VjlVjVjVj,VjlVjVjVj,VjlVjVjVj,VjlVjVjVj,VjlVjZVj[VjT[Vj[Vj[Vj\VjT\Vj\VjT]Vj]Vj]Vj^VjT^Vj^Vj^Vj_VjT_Vj_Vj_Vjt)Z0:[DB= J  \ &!j.m7IB i~@CTD*pO !"}#%1&&'((**n+,012=3S3i3Q55266758D8G88889 99:$:";;;<==x>?b@AA4B=BB8C>CC,DD EEKFGpHHHkItI#J,JJJ5KK`LLLLLMMMMNNOOOO&PPPPPQQQQxRR)SFSSSS!TTTU:V{VV5WUWWWWXBYYY+ZZR[]^^^_``2aabMcccd!d#d0dKddeDf"ggghbi3jjkEllmmmVnyn+o&pqrrrMstssttuuuxxxyyy zozz {{#{|{{||||,}8}E}~~3Lt H',kÇ)5f **azxܒ>>i $٘ zeA{͛sΠaȡ-CBq}D۬p/\ܷ&k )/KTp վ|:`i!`snhy/3#&,mryX]dmr$*/6?D]c Khu#0<?KN`cloz},/;>JMWY_ %/11YcftwDGMPUblrjry$5>AKNY\bk)+/07@CCORY_)DPW`otx ")/TW`fL      !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~      !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~      !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~[1;\EC> K  ] '"k/ n8JC jADUE+qP !"~#%2&&')(**o+,012>3T3j3R55366768E8H88889 99:%:#;;;<==y>?c@AA5B>BB9C?CC-DD EELFGqHHHlIuI$J-JJJ6KKaLLLLLMMMMNOOOOO'PPPPQQQQQyRR*SGSSSS"TTTU;V|VV6WVWWWWXCYYY,ZZS[]^^^_``3aabNcccd"d%d1dLddeEf#ggghci4jjkFllmmmWnzn,o'pqrrrNsussttuuuxxxyyy zpzz {{${}{{||||-}9}F}~~9MuI(-lć*6g ++g{yݒ??j%ژ{fB|ΛtϠbɡ.DCr~Eܬq0]ݷ'l*0LUq ־};aj"atoiz04$'-nszY^ens*+07@E^d Liv$1=@LOadmp{~ -0<?KNXZ`!&0==ZdguxEHNQVcmsksz%6?BLOZ]cl *.118AMMPSZ`*EQXapuy  #*0 UXagM  !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~      !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~      !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~=:*urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags PlaceType=;*urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags PlaceName8*urn:schemas-microsoft-com:office:smarttagsCity9*urn:schemas-microsoft-com:office:smarttagsplaceC*urn:schemas-microsoft-com:office:smarttagsmetricconverter>*urn:schemas-microsoft-com:office:smarttags PersonName 10, a1998. A200 mM6, a7C8, a8C ProductID;:##%&''|)))))),,,,,+,=,O,[,],u,,,,---------...[._.....@/G///30B0Q0b0d0g0l1p12292;222^3b3t3x333&585@@L MMMNN P&PU VUVcVVVVV~WWWWWWWW=XMX$Y,Y-Y0Y1Y8YcYkYlYoYpYwY ZZZZZ!ZZZZZZZ__bbbbbbeeKePeeeWfbfff5g@gggghhhhhfmmmooMpSp.t U5;N8_ 7q@LxO]1Ot Upl[U]pp_;ifVp {_ 7qY5sY5s {5;N8\N}z 6; ^{Iglz|`l8_3iCp$5bQ;ZFp( ) p, M OV X zw h s { U ` i 9 @  =ot~f11# ?IKVb7mC'_WanAp$jO?^7Z[+| <=M Y}^[c%lK &.t?R^oVwY7xK_5j8p  << A O s  !\1!\L!n!!"=#s_#`#<$ '$J$$N$4|$%l-%=%xQ%f%z%]/&P(M(Y(u( )T )QB)=*O*+[j+, ,!,-W\-i-G.J/ //0E0P0F1%{1i25}2 3N3XP3i3ci3B4p455'6(6d6v6}6k7d7$ 8!878H9l9G:k3:];X0;Y1<\,=H=h=><>,d>?6?zG?,V?l?Bt?E@bi@{@zA{A BQWBC$D8DlDzD8 EQEhEFl2FWpGE}GmWH`HjHpHXBISIJJJ8JBJ"yJK#Kq6KOKmUKj LLR0L5LALMLmLuL]MmN)N93N!8NrN=Oc>PAQ*PQVQeRR R;uRSRST}#T?T]T(UrKU,QUpRUWUA VVhVpVWKWSWMXAYXUrX YAYXYuYuYyY ZeZ[e[ \Uk\C]]5F]&]]&`]i ^D`&A`%M`M`:O`8x` aa#acb,cmc@$dd-dfdee f9fg#gd1gh,h0h i.iJEiTi}ix j%=j[jgj`k$k"l7lW=lrlU`4 Q[ U*X@L>By4b 8+>l4}7>U4]3*Y+XT`),cTgDbF {,Zd5Vj'*i8.>abUxMRVWHdua0r>{#Ei#gv*gl# t S<<0qD^vyk_O?lKNqt/1H1uy8\|G>e p >F%\T05O/]uF!2B6a:gBhw8Pk6I:)>Am '#( +3z*<?.2Y-d U m n ;L*STk98RvStj?7PW)Mon c @Gdew<gXn :+.vz;LNw}< 6 fKBZ'XI,F| i8".95kTNJoHA `\co 'Yd^h j28kGmJDRL'"Wn/jZojl@  #&()+,-./0124589>IKNQRUYZ[]`bcfhklnopqqpp ppppp$p(p.p0pBpDpFpHpNpTpXpZp^p`pbpdpfphpjplppprpxpzppppppppppppppppppppppp6UnknownG* Times New Roman5Symbol3. * Arial7.{ @CalibriI. ??Arial Unicode MS?= * Courier New5. *aTahomaA BCambria Math"1!!Z X sX s!4d 2qHX $P !xx0Ochrona patentowa biaBka TROSPA pochodzcego z IAnna UrbanowiczAnna Urbanowicz(       Oh+'0 ,8 X d p |4Ochrona patentowa biaka TROSPA pochodzcego z IAnna UrbanowiczNormalAnna Urbanowicz2Microsoft Office Word@@ܒ^ӭ@>e@>eX ՜.+,0  hp   ICHB PANs 1Ochrona patentowa biaka TROSPA pochodzcego z I Tytu  !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~      !"#$%&'()*+,-./0123456789:;<=>?@ABCEFGHIJKMNOPQRSTUVWXYZ[\]^_`abcdefghijklmnopqrstuvwxyz{|}~Root Entry F fData D1TableLWordDocument?SummaryInformation(DocumentSummaryInformation8CompObj  F0Dokument programu Microsoft Office Word 972003 MSWordDocWord.Document.89q